光學(xué)成像可用于發(fā)育生物學(xué)，從而了解生物體的形成、揭示組織再生機(jī)制、認(rèn)識(shí)并管理先天性缺陷和胚胎衰竭等。其中最受關(guān)注的兩個(gè)問(wèn)題：一是心臟在早期發(fā)育中會(huì)發(fā)生劇烈的形態(tài)變化，其潛在功能和生物力學(xué)方面仍有待研究；二是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常會(huì)導(dǎo)致先天性的疾病，所以需要從動(dòng)力學(xué)、功能和生物力學(xué)等方面對(duì)大腦發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了解。

許多光學(xué)顯微鏡都依靠使用熒光標(biāo)記物來(lái)對(duì)特定分子或物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記然后成像。但是熒光標(biāo)記有標(biāo)記不均勻、光漂白、熒光劑干擾細(xì)胞功能、熒光劑無(wú)法標(biāo)記小分子等問(wèn)題。所以，無(wú)標(biāo)記成像對(duì)于發(fā)育生物學(xué)十分重要。

表1列出了多種應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的無(wú)標(biāo)記成像：OCT為光學(xué)相干層析成像，OCM為光學(xué)相干顯微鏡，RM為拉曼顯微鏡，BM為布里淵顯微鏡，SHGM為二次諧波顯微鏡，THGM為三次諧波顯微鏡，OPT為光學(xué)投影層析成像，PAT為光聲層析成像，PACT為光聲計(jì)算機(jī)斷層掃描，PAM為光聲顯微鏡，QPI為定量相位成像。

表1 應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的無(wú)標(biāo)記成像 ［1］OCT是一種基于低相干性干涉測(cè)量法的光學(xué)成像技術(shù)， 主要應(yīng)用于組織結(jié)構(gòu)、脈管系統(tǒng)、血液循環(huán)和生物力學(xué)的成像。其分辨率1－15 um，成像深度在1－2 mm量級(jí)，具有非侵入式、無(wú)預(yù)處理、快速成像、實(shí)時(shí)3D建模評(píng)估等優(yōu)點(diǎn)。OCT可分為時(shí)域OCT和頻域OCT（圖1）。時(shí)域OCT利用光程匹配的組織反射光與參考光的干涉信號(hào)成像，因此需要調(diào)節(jié)參考鏡的位置來(lái)掃描不同深度的組織信息。頻域OCT的參考鏡是固定的，僅通過(guò)測(cè)量組織反射光和參考光疊加后的光譜并作傅里葉變換，即可獲得與時(shí)域OCT相同的結(jié)果。相較于時(shí)域OCT，頻域OCT的靈敏度和成像速度均大幅提升。

圖1． 時(shí)域OCT與頻域OCT的原理示意圖 ［2］OCM是OCT和共聚焦顯微鏡相結(jié)合的產(chǎn)物（圖2）， 主要應(yīng)用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織結(jié)構(gòu)的成像。相較OCT，OCM的對(duì)比度來(lái)源更豐富，空間分辨率也更高，3D分辨率達(dá)到1－2 ？m的同時(shí)可保持約0．5 mm的成像深度。OCM常用于植入前發(fā)育的胚胎成像。鑒于OCM與OCT相同的對(duì)比機(jī)制，也可用于功能性O(shè)CM成像，例如血管造影。

圖2． 一種OCM的示意圖 ［3］RM主要應(yīng)用于生物分子的成像， 對(duì)于胚胎成像，RM可提供非常豐富的分子信息。例如，在植入前階段，脂質(zhì)在胚胎發(fā)育中起重要的代謝作用。RM可以對(duì)脂質(zhì)液滴的數(shù)量和空間分布進(jìn)行長(zhǎng)期的評(píng)估，從而進(jìn)一步表征脂質(zhì)在胚胎發(fā)育中的功能。BM是一種基于探測(cè)布里淵散射的非線性成像方法， 主要應(yīng)用于生物力學(xué)成像。布里淵散射是光在介質(zhì)中受到各種元激發(fā)的非彈性散射，其頻率變化表征了元激發(fā)的能量。與拉曼散射不同的是，布里淵散射涉及的是能量較小的元激發(fā)，如聲學(xué)聲子和磁振子等。光波與千兆赫茲頻率的聲波（聲子）相互作用，所產(chǎn)生的光頻移反映了樣品的高頻彈性模量。因此，BM可用于測(cè)量材料的彈性性能，對(duì)于探測(cè)胚胎的韌性（剛度）具有很高的價(jià)值。SHG過(guò)程對(duì)有序的非中心對(duì)稱分子結(jié)構(gòu)具有高度特異性，因此可為某些細(xì)胞和組織成分（如膠原蛋白、微管和肌球蛋白）提供清晰的成像對(duì)比度，這對(duì)胚胎評(píng)估非常有用。例如，SHG顯微鏡可用于對(duì)果蠅胚胎的肌肉結(jié)構(gòu)和氣管系統(tǒng)成像。以及用于小鼠胚胎心臟中纖維結(jié)構(gòu)的3D成像，顯示了心臟纖維含量和組織的時(shí)間變化和空間異質(zhì)性（圖3）。

圖3． 胚胎第8．5天時(shí)小鼠胚胎心臟中的纖維結(jié)構(gòu)的SHG成像。（A） 整個(gè)心臟的SHG圖像的3D重建，包括原始心房、原始心室和流出道；（B、C） （A）中所示位置的橫截面圖；（D－F） （A）中所示位置：（D） 流出道和（E、F） 心室的放大圖像；（F）在心臟表面以下15米處。［1］THG通常發(fā)生在折射率失配的結(jié)構(gòu)界面處。對(duì)于胚胎成像，THG顯微鏡主要用于提供高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。另外，由于THG信號(hào)能夠很好地描繪細(xì)胞膜，THG顯微鏡還可用于細(xì)胞追蹤，包括探測(cè)秀麗隱桿線蟲胚胎的早期細(xì)胞分裂以及測(cè)量青蛙胚胎的血流速度。光學(xué)投影層析成像（OPT）與CT原理相同（圖4）。首先得到樣品在不同方向上的投影數(shù)據(jù)，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)重建得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。OPT成像模式有兩種：透射OPT（或明場(chǎng)OPT），其對(duì)比度來(lái)自樣品的光吸收；發(fā)射OPT，其對(duì)比度來(lái)源于樣品的自發(fā)熒光信號(hào)或熒光染色劑信號(hào)?；跓晒獾腛PT是研究整個(gè)胚胎中3D基因表達(dá)模式的重要方法，基于無(wú)標(biāo)記吸收的OPT則主要用于了解器官的形態(tài)，用于胚胎的定量形態(tài)成像。無(wú)標(biāo)記OPT也被用于早期人類胚胎的成像，著眼于大腦發(fā)展，表明神經(jīng)系統(tǒng)中的許多結(jié)構(gòu)都可以在3D模式下被識(shí)別。

圖4． 計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（CT）原理示意圖。［4］PAT的原理為光聲效應(yīng)：當(dāng)激光照射組織時(shí)，組織會(huì)吸收激光的能量，溫度上升并膨脹。當(dāng)目標(biāo)組織被周期性強(qiáng)度調(diào)制的激光照射時(shí)，則會(huì)發(fā)生周期性的熱脹冷縮，從而發(fā)出超聲波。光聲成像檢測(cè)的便是組織受光激發(fā)產(chǎn)生的超聲信號(hào)。在成像過(guò)程中，組織受激光照射熱脹冷縮，在組織內(nèi)部形成了一個(gè)初始聲場(chǎng)。超聲換能器在組織周圍接收傳播出來(lái)的聲波，利用聲波信號(hào)和相應(yīng)的重建算法，反向重建出初始聲場(chǎng)，從而得到組織的激光吸收率分布圖像（圖5）。而且，由于樣品內(nèi)部不同深度位置的聲信號(hào)到達(dá)樣品表面的超聲信號(hào)存在時(shí)間差異，利用時(shí)間分辨技術(shù)可獲得不同層析面的光聲信號(hào)，由此可重建3D的光聲圖像。

圖5． PAT的原理示意圖。［5］PAT不僅是非侵入式，無(wú)需標(biāo)記的成像方法，還結(jié)合了光學(xué)高對(duì)比度和聲學(xué)高分辨率的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)施加不同的光波長(zhǎng)，PAT還有極其豐富的對(duì)比度來(lái)源，如血紅蛋白、黑色素、DNA ／ RNA、脂質(zhì)和水。利用氧合和脫氧血紅蛋白的不同吸收光譜，PAT不僅可以進(jìn)行脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)成像和血液循環(huán)功能成像，還可以進(jìn)行氧飽和度和耗氧代謝成像。相襯顯微鏡技術(shù)用于弱散射或吸收光的生物樣品（例如植入前的胚胎）?；谕干涿鲌?chǎng)顯微鏡，通過(guò)相干光干涉來(lái)探測(cè)相襯，從而分辨出相對(duì)透明的細(xì)胞成分。定量相位成像（QPI）作為一種先進(jìn)的相襯顯微鏡技術(shù)已被用于不同類型的細(xì)胞，并在了解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織、同時(shí)評(píng)估細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)以及測(cè)量細(xì)胞力學(xué)方面得到了應(yīng)用。以上這些用于發(fā)育生物學(xué)的無(wú)標(biāo)記成像模式之間存在相似的成像功能，接著比較一下它們針對(duì)特定應(yīng)用的差異：OCT和OPT均可用于組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的成像，且都有微米水平的分辨率。其中OPT具有更高的成像深度，能夠覆蓋整個(gè)大尺寸胚胎，而OCT由于成像深度的限制，僅限于探測(cè)靠近表面的組織結(jié)構(gòu)。不過(guò)，OCT可用于活體動(dòng)態(tài)成像，OPT則不適合。對(duì)于血管成像，PAT直接測(cè)量血紅蛋白的光吸收，可以從組織內(nèi)部深處進(jìn)行體積重建，而OCT通過(guò)功能性血流分析只能以相對(duì)有限的深度實(shí)現(xiàn)脈管系統(tǒng)成像。但OCT的優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)γ}管系統(tǒng)和高分辨率組織結(jié)構(gòu)同時(shí)成像，這點(diǎn)PAT難以實(shí)現(xiàn)。對(duì)于胚胎組織的生物力學(xué)成像，基于OCT的彈性成像需要適當(dāng)?shù)呢?fù)荷（loading）才能傳遞到目標(biāo)位置。對(duì)于心臟，主動(dòng)收縮力是自然負(fù)荷，使OCT能夠評(píng)估心臟壁的應(yīng)變和應(yīng)變率。但是，對(duì)于其他器官或組織，OCT的生物力學(xué)成像可能會(huì)因缺乏合適的負(fù)荷（suitable loading methods）而受到限制。與OCT不同，BM進(jìn)行生物力學(xué)成像，不需要外部負(fù)荷（loading），理論上能夠應(yīng)用于任何可收集布里淵散射光的胚胎組織。發(fā)育過(guò)程是非常多樣的，單一類型的成像只能提供有限的信息。以上部分成像方式雖存在相似的功能但各有優(yōu)勢(shì)，所以將不同的成像方式結(jié)合在一起的多模態(tài)成像方法前景廣闊。往期精彩：

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