外泌體因其與親代細胞的高度同源性而在臨床診斷中發(fā)揮著非常重要的作用。然而，傳統(tǒng)的外泌體檢測方法仍面臨設備昂貴、靈敏度低、程序復雜等挑戰(zhàn)。場效應晶體管（FET）不僅是現(xiàn)代微電子工業(yè)中最重要的電子元件，而且由于其具有快速響應、高靈敏度和無標記檢測等優(yōu)點，在生物分子檢測方面顯示出巨大潛力。

據麥姆斯咨詢報道，中國科學院微電子研究所（Institute of Microelectronics，Chinese Academy of Sciences）的研究人員開發(fā)了一種用特定抗體進行化學修飾的硅（Si）納米線場效應晶體管（Si-NW Bio-FET）器件，用于外泌體的電學和無標記檢測。相關研究以“Si nanowire Bio-FET for electrical and label-free detection of cancer cell-derived exosomes”為題發(fā)表在Microsystems & Nanoengineering期刊上。

首先，研究人員對硅納米線Bio-FET進行了制造和表征，如圖1a和圖2所示，該器件由硅納米線FET器件和PDMS微流體層構成，尺寸為15mm × 26mm，具有用于通過外部注射泵加載外泌體樣品的入口和出口（圖2a）。通過SEM成像技術可觀察到均勻的硅納米線（Si-NW，圖2b），其長10μm、寬45nm、高29nm，具有矩形橫截面。外泌體特異性抗體共價固定在硅納米線的表面，作為外泌體靈敏檢測的識別元件（圖1b）。此外，抗體與外泌體之間的親和相互作用可能會引起硅納米線Bio-FET器件的電響應（即漏極電流變化和閾值電壓變化），從而實現(xiàn)外泌體的電學和無標記檢測（圖1c）。

圖1 a）硅納米線Bio-FET示意圖；b）硅納米線Bio-FET橫截面示意圖；c）信號變化示意圖；d）硅納米線Bio-FET的簡化制造工藝示意圖：（I）具有p型（100）晶面的SOI晶圓；（II）頂部硅層的減??；（III）SiO2/α-Si/Si3N4層的沉積；（IV）α-Si的圖案；（V）Si3N4的沉積；（VI）Si3N4硬掩模的形成；（VII）去除α-Si；（VIII）SiO2和頂部硅反應離子刻蝕（RIE）；（IX）硅納米線的形成。

圖2 a）硅納米線Bio-FET圖像；b）硅納米線區(qū)域的SEM圖像（比例尺為5μm）：插圖I為硅納米線橫截面；插圖II為硅納米線俯視圖。

接著，研究人員使用硅納米線Bio-FET對外泌體進行電學和無標記檢測。CD63蛋白作為跨膜-4超家族（transmembrane-4 superfamily）的成員之一，已被發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)外泌體亞群中含量豐富。此外，CD63蛋白在A549外泌體表面高度表達，因此，研究人員選擇CD63抗體作為捕獲抗體。

為了研究Bio-FET對外泌體的反應，利用A549細胞培養(yǎng)物的上清液（其中存在來自A549細胞系的外泌體顆粒）作為分析物，并在經過CD63抗體修飾后，使用Bio-FET檢測A549細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體。

圖3a顯示了分別用PBS以及10倍和100倍稀釋的A549細胞培養(yǎng)上清液測量的Bio-FET的漏極電流-柵極電壓（ID-VG）轉移曲線。ID-VG曲線顯示，A549上清液稀釋液中的ID值低于空白PBS溶液。此外，ID隨著稀釋因子的降低（溶液中外泌體濃度的增加）而降低。PBS、100倍稀釋的A549上清液和10倍稀釋的A549上清液的閾值電壓（Vth，對應ID為2.19?nA的柵極電壓）分別為-1.35?V、-2.16?V和-3.03?V。隨著外泌體濃度的增加，Vth向左移動。因此，實驗結果表明，Bio-FET可成功測量A549細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體濃度，且ID-VG曲線的變化與外泌體濃度有關。

圖3 a）用PBS和不同稀釋度的A549細胞培養(yǎng)上清液測量的硅納米線Bio-FET的ID-VG曲線；b）由CD63抗體修飾的硅納米線捕獲的外泌體的SEM圖像（比例尺：400nm）；c）DiO染色后CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET的熒光圖像；d）無CD63抗體修飾的硅納米線的SEM圖像（比例尺：400nm）；e）DiO染色后未經抗體修飾的硅納米線Bio-FET的熒光圖像（比例尺：500μm）。

為了驗證外泌體是否可以被捕獲在硅納米線Bio-FET表面，研究人員使用SEM進行觀察。圖3b的SEM圖像中的紅色虛線圓圈內區(qū)域清楚地顯示了外泌體在硅納米線上被捕獲。相比之下，沒有CD63抗體修飾的硅納米線上幾乎沒有外泌體顆粒（圖3d），從而證明了外泌體被CD63抗體成功捕獲在硅納米線上。為了進一步驗證硅納米線上外泌體的存在，研究人員將CD63抗體捕獲的外泌體用DiO染料染色，該染料可以染色外泌體的脂質雙層膜。通道內的熒光圖像如圖3c、3e所示。與未經抗體修飾的硅納米線Bio-FET相比，CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET內部顯示出熒光強度顯著增加，進一步證明了外泌體被抗體成功捕獲。

為了進一步測試硅納米線Bio-FET對外泌體檢測的敏感性，研究人員通過超速離心（UC）純化了A549衍生的外泌體樣品。首先將外泌體濃度由1.84?×?10?個顆粒/mL稀釋至1.84?×?10?顆粒/mL~1.84?×?10?顆粒/mL區(qū)間的不同濃度，并將這些樣品應用于CD63抗體修飾的硅納米線Bio-FET，隨后記錄硅納米線Bio-FET的ID-VG曲線。如圖4a所示，漏極電流隨著檢測過程中外泌體濃度的增加而降低。此外，隨著外泌體濃度的增加，Vth向左移動，且未結合的抗體位點逐漸被填充，導致電流逐漸減小。圖4b顯示了外泌體濃度和電壓閾值之間的線性關系，獲得的校準曲線顯示在4-log動態(tài)范圍內可以進行定量檢測，在3σ處的檢測限（LOD）為2159個顆粒/mL（約等于2個顆粒/μL），高于一些基于電化學和其他方法的檢測。通過設計微通道結構以增強分析物溶液與通道底部納米線之間的相互作用，可以進一步提高檢測靈敏度。

圖4 a）硅納米線Bio-FET與不同濃度外泌體相互作用的轉移曲線；b）硅納米線Bio-FET在一系列外泌體濃度下的Vth。

最后，研究人員研究了硅納米線Bio-FET的實時檢測能力。將樣品注入微通道5分鐘后測量實時ID。VG和VD分別設置為-5V和-1.2?V。不同外泌體濃度的實時ID如圖5a所示。從圖中可以看出，隨著時間的增加，ID趨于保持不變，隨著濃度的增加，ID逐漸減小，而穩(wěn)態(tài)ID和外泌體濃度之間呈對數(shù)呈線性關系（圖5b）。

對微流控通道內外泌體濃度和漏極電流的關系進行研究，結果如圖5c所示，外泌體濃度的增加導致漏極電流降低。此外，對微通道內外泌體濃度降低的實時檢測結果表明，當新的外泌體溶液注入通道時，如果抗體結合位點未被占據，外泌體與抗體的結合會繼續(xù)，從而進一步降低電流。因此，硅納米線Bio-FET具有實時監(jiān)測微流體通道中分析物濃度變化的潛力。

圖5 a）不同濃度外泌體溶液的實時響應；b）穩(wěn)態(tài)漏極電流與外泌體濃度之間的關系；c）微通道內外泌體濃度變化時漏極電流的實時響應。

總之，該研究開發(fā)了一種高度靈敏的CD63抗體功能化硅納米線Bio-FET，用于外泌體的電學和無標記檢測。結果表明，硅納米線Bio-FET對A549外泌體的檢測限為2159個顆粒/mL，高于許多其他電化學方法。此外，硅納米線Bio-FET能夠實時監(jiān)測外泌體的變化，其實時電流隨著外泌體濃度的增加而降低。從而為靈敏、無標記和實時的外泌體檢測提供了一種新的CMOS兼容策略，有望在未來用于實時監(jiān)測和臨床診斷。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41378-022-00387-x

審核編輯 ：李倩