人工構(gòu)建基因回路有兩種常用的策略。第一種是基于理論設(shè)計(jì)的“即插即用”模式，研究者利用已被定量刻畫(huà)的基因元件，結(jié)合理論計(jì)算模型來(lái)構(gòu)建基因回路，以使之產(chǎn)生特定功能。第二種則是基于高通量篩選的定向進(jìn)化，或“突變-篩選”模式，在此模式下，研究者往往需要對(duì)回路中重要的原件構(gòu)建規(guī)模龐大的突變體文庫(kù)并隨后進(jìn)行篩選，以獲得所需的表型。

對(duì)于后者而言，盡管大規(guī)模的建庫(kù)-篩選技術(shù)近年來(lái)已經(jīng)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，然而對(duì)于一些復(fù)雜的表型，特別是涉及到時(shí)間依賴的動(dòng)力學(xué)行為時(shí)，同時(shí)記錄大規(guī)模突變體庫(kù)的動(dòng)力學(xué)表型是困難的。近期，美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校Jeff Hasty課題組在Cell Systems上發(fā)表以“Design， mutate， screen： Multiplexed creation and arrayed screening of synchronized genetic clocks”為題的研究論文，介紹了其新開(kāi)發(fā)的微流控芯片，基于此芯片可以在顯微鏡下同時(shí)記錄大量細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)行為。

圖1 Hasty實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的微流控芯片，可以同時(shí)追蹤48個(gè)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)。

應(yīng)用這一微流控系統(tǒng)，研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的群體振蕩基因回路進(jìn)行了突變-篩選。該基因回路利用細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，通過(guò)AHL分子進(jìn)行細(xì)胞間通訊，使細(xì)胞群體以共同的節(jié)律表達(dá)細(xì)胞裂解相關(guān)蛋白，從而產(chǎn)生群體的同步化振蕩（如圖2所示）。研究人員首先對(duì)裂解蛋白的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）序列中的五個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了突變，并隨機(jī)選取其中24個(gè)分別用96孔板和微流控系統(tǒng)進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，在96孔板中生長(zhǎng)的細(xì)菌群體無(wú)法表現(xiàn)出規(guī)則的振蕩行為，而在微流控篩選系統(tǒng)中則可以表現(xiàn)出周期性振蕩。研究人員進(jìn)一步定量測(cè)定了不同突變體在不同條件下的振蕩周期和振幅，并展示這一系統(tǒng)可以用于精確調(diào)整振蕩系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

圖2 應(yīng)用微流控系統(tǒng)規(guī)模化篩選具有不同振蕩周期的菌株

接著，研究人員挑選篩選所得的兩個(gè)菌株（pSpSLC?和pSpSLC??，以下簡(jiǎn)稱0號(hào)和10號(hào)）進(jìn)行了深入分析。相比而言，10號(hào)菌株的振蕩更慢，振幅更高。研究人員首先在無(wú)反饋的菌株內(nèi)刻畫(huà)了兩種RBS的強(qiáng)度，并畫(huà)出了兩種RBS下細(xì)胞裂解對(duì)AHL的劑量響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)0號(hào)菌株（快振蕩）的EC50要顯著小于10號(hào)菌株（慢振蕩）的EC50值，這一結(jié)果與數(shù)學(xué)模型定性地吻合。

圖3 更慢的振蕩周期對(duì)應(yīng)更強(qiáng)的AHL響應(yīng)

此外，研究人員應(yīng)用前任發(fā)展的RBS計(jì)算器對(duì)這兩個(gè)篩選得到的RBS序列進(jìn)行了強(qiáng)度預(yù)測(cè)，但結(jié)果顯示二者并沒(méi)有明顯區(qū)別（在誤差精度范圍內(nèi)）。研究人員分析產(chǎn)生這一結(jié)果原因可能在于下游裂解蛋白濃度與細(xì)胞裂解之間的非線性關(guān)系，即微小的RBS強(qiáng)度改變也可能帶來(lái)細(xì)胞裂解水平的很大變化。這進(jìn)一步說(shuō)明了規(guī)模化文庫(kù)篩選的重要性——即便是在很大程度上可以被理性設(shè)計(jì)的基因回路中，也會(huì)有潛在的、未被充分考慮的復(fù)雜性。

最后，研究人員應(yīng)用這一篩選平臺(tái)構(gòu)建了一個(gè)不依賴于細(xì)胞裂解的新型群體振蕩回路。該回路由簡(jiǎn)單的負(fù)反饋構(gòu)成：細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)生的AHL可以誘導(dǎo)tetR的表達(dá)，而tetR又可以抑制AHL的表達(dá)。初始構(gòu)建的菌株并未表現(xiàn)出明顯的振蕩特征，研究人員隨后對(duì)tetR的RBS構(gòu)建了突變體文庫(kù)，并選擇其中在分批培養(yǎng)條件下具有脈沖式動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象的菌株進(jìn)行了微流控平臺(tái)篩選，最終得到了具有穩(wěn)定振蕩表型的菌株。相比初始菌株而言篩選得到的菌株明顯具有更穩(wěn)定的振蕩周期。

圖4 篩選前后細(xì)胞群里動(dòng)力學(xué)的對(duì)比（c圖上半部分為篩選前的細(xì)胞群體動(dòng)力學(xué)，下半部分為篩選后的群體動(dòng)力學(xué)，可以看到發(fā)生了規(guī)律的周期振蕩）。

綜上所述，研究人員開(kāi)發(fā)了一種可以規(guī)?；Y選細(xì)胞群體動(dòng)力學(xué)的技術(shù)平臺(tái)，應(yīng)用這一平臺(tái)可以有效地獲得具有預(yù)期的定量表型的菌株，并可以用來(lái)篩選產(chǎn)生全新動(dòng)力學(xué)行為的菌株（從衰減振蕩到持續(xù)振蕩），為復(fù)雜基因回路的規(guī)模化篩選與定向進(jìn)化提供了新的思路和工具。

原文標(biāo)題：基于微流控芯片的分子鐘基因回路的高通量設(shè)計(jì)與篩選技術(shù)

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