介紹

超分辨率顯微成像是一系列能夠使研究人員能夠“打破”光學(xué)顯微鏡衍射障礙的方法，在該系列方法中分辨率最高的技術(shù)為光激活定位顯微技術(shù)（PALM）。這些方法依賴(lài)于在數(shù)千幀中對(duì)單個(gè)分子的隨機(jī)子集進(jìn)行定位（SMLM），并將這些個(gè)體的定位重構(gòu)為單個(gè)超分辨率圖像。傳統(tǒng)的定位顯微鏡可以在橫向維度上進(jìn)行10~20nm的精確成像，為了實(shí)現(xiàn)更高的定位精度，要求顯微鏡配置具有更高信噪比的靈敏探測(cè)器。盡管橫向分辨率令人印象深刻，但傳統(tǒng)的2DSMLM仍通常缺乏軸向分辨率。

美國(guó)DoubleHelixOptics公司的SPINDLER系列3D顯微鏡成像模塊與3DTRAXR軟件相結(jié)合，可在三維尺度上實(shí)現(xiàn)高精度、亞衍射極限定位，并具有擴(kuò)展的深度成像能力。SPINDLE采用精密光學(xué)器件設(shè)計(jì)，可與市面上在售的科學(xué)顯微鏡無(wú)縫集成，并提供前所未有的橫向和軸向精密成像組合。用戶(hù)可根據(jù)具體的應(yīng)用選擇合適的相位掩模版以實(shí)現(xiàn)基于深度范圍、發(fā)射波長(zhǎng)和信噪比等參數(shù)對(duì)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的優(yōu)化，更重要的是，SPINDLE可在無(wú)需掃描的情況下在單張圖像中將傳統(tǒng)成像系統(tǒng)的景深擴(kuò)大10倍。

在本文中，我們展示了如何將SPINDLE成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡結(jié)合使用以在所有三個(gè)維度（x、y、z）上實(shí)現(xiàn)亞衍射極限成像。SPINDLE可與任何高質(zhì)量的科學(xué)相機(jī)兼容，無(wú)論是emccd還是scmos都可以提供定位顯微鏡所需的高信噪比圖像。

使用SPINDLE和DH-PSF相位掩模版對(duì)細(xì)胞微管進(jìn)行三維超分辨成像

在本文中，我們證明了使用SPINDLE單通道模塊可以實(shí)現(xiàn)高精度、大深度的超分辨率重建。如圖1所示，使用Double Helix (DH-PSF) 的相位掩模版與SPINDLE單分子定位顯微鏡組件結(jié)合。系統(tǒng)將單個(gè)分子發(fā)出的光分成兩個(gè)光瓣，通過(guò)找到兩個(gè)光瓣的中心來(lái)檢索發(fā)光點(diǎn)的橫向（x-y）位置；兩光瓣之間的角度編碼了發(fā)光點(diǎn)的軸向（z）位置。這些額外的信息將有助于在橫向和軸向尺寸上以非常高的精度（<20nm）進(jìn)行超分辨率重建。此外，SPINDLE擴(kuò)展了分子可以定位的景深，這種精確度和擴(kuò)展深度成像的結(jié)合能夠以顯著提高的z軸分辨率以收集更多的數(shù)據(jù)。

圖1：基于單分子定位顯微成像技術(shù)（SMLM）技術(shù)的帶有可互換相位掩模支架的SPINDLE模塊

為了演示SPINDLE的工作原理，我們使用NikonN-STORM顯微鏡結(jié)合PhotometricsPrime95B相機(jī)對(duì)被AlexaFluor647偶聯(lián)微管蛋白抗體標(biāo)記的Cos7細(xì)胞進(jìn)行了成像。對(duì)于該樣品，我們使用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的相位掩模版，該掩模版可與遠(yuǎn)紅外波長(zhǎng)染料和1.49NA的100倍物鏡配合使用。樣品在640 nm激光連續(xù)照射下在Prime95B上成像，曝光時(shí)間為30 ms。使用3DTRAX軟件對(duì)單發(fā)射點(diǎn)進(jìn)行定位，并將結(jié)果導(dǎo)出到ImageJ插件Thun-derSTORM。使用歸一化高斯方法重建圖像，并使用ImageJ查找表“Spectrum”以顏色對(duì)z深度進(jìn)行編碼。

圖2：?jiǎn)蝹€(gè)100nm珠在Prime95B上使用SPINDLE在焦平面（0μm）和焦平面上方（+1μm）和下方（-1μm）微米處的成像圖

重建的結(jié)果包含超過(guò)200萬(wàn)個(gè)定位，并顯示Cos7細(xì)胞中微管的30μmx30μm視野、深度超過(guò)2.1μm的范圍（圖3左）。深度以顏色編碼，細(xì)胞底部為紅色/紫色，頂部附近為黃色/橙色。放大的插圖顯示微管在一定深度范圍內(nèi)得到了很好的重建（圖3，右）。這些數(shù)據(jù)突出了使用Double Helix SPINDLE模塊帶來(lái)的擴(kuò)展景深成像和高橫向和軸向分辨率。

使用Double Helix 3DTRAX軟件進(jìn)行高精度三維定位

DoubleHelix3DTRAX軟件是一個(gè)ImageJ/FIJI插件，其可以在橫向和軸向以亞衍射極限精度定位單個(gè)分子。3DTRAX還使用克拉美-拉奧下限(CRLB)5計(jì)算了每個(gè)定位分子的精度值。該計(jì)算基于每個(gè)定位的信噪比。

圖3：使用SPINDLE(R)和Prime95B成像的微管三維超分辨率重建圖。左圖：Cos7細(xì)胞免疫染色的微管蛋白，顏色編碼深度。右圖：左側(cè)圖像的放大區(qū)域，顯示了深度超過(guò)2微米的微管。圖片由DoubleHelixOptics提供。平均CRLB值橫向約10nm，軸向約20nm（圖3）

概括

Double Helix的SPINDLE超分辨率3D顯微成像模組、相位掩模和3DTRAX軟件的組合可實(shí)現(xiàn)高精度大深度三維成像、跟蹤和計(jì)數(shù)。在此應(yīng)用中，我們?cè)趤喖?xì)胞結(jié)構(gòu)的三維超分辨率重建中展示了大約10nm的橫向精度和20nm的軸向精度。SPINDLE系列產(chǎn)品為研究人員提供了強(qiáng)大的工具集，可促進(jìn)對(duì)廣泛生物系統(tǒng)中分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)相互作用的理解。

圖4：橫向和軸向精度。用于重建圖2所示圖像的定位精度值。精度值由3DTRAX軟件根據(jù)其信噪比使用每個(gè)發(fā)射器的Cramer-Rao下界5計(jì)算得出。定位數(shù)顯示在y軸上，精度值(nm)顯示在x軸上

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關(guān)于Double Helix Optics

美國(guó)DoubleHelixOptics是一家位于美國(guó)科羅拉多州博爾德的計(jì)算光學(xué)公司。Double Helix Optics采用其專(zhuān)利的雙螺旋光工程成像技術(shù)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)下一代高精度3D成像產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)3D的成像、跟蹤和計(jì)數(shù)。

DoubleHelix的SPINDLE系列成像模塊與可切換的相位掩模庫(kù)以及用于計(jì)算重建和分析的軟件相結(jié)合，確保為我們的客戶(hù)及其應(yīng)用的具體情況提供最高質(zhì)量的3D成像技術(shù)。

關(guān)于昊量光電：

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審核編輯 黃昊宇