超聲基因轉(zhuǎn)移比其他細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)更有優(yōu)勢，因?yàn)槌暡恢苯幼饔糜诩?xì)胞，而是通過聲孔效應(yīng)將細(xì)胞周圍的基因片段推入細(xì)胞。據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，一支由中國廣西大學(xué)和中國科學(xué)院智能機(jī)械研究所的研究人員組成的團(tuán)隊(duì)在Micromachines期刊上發(fā)表了題為“A Microfluidic System of Gene Transfer by Ultrasound”的論文。該論文提出的微流控系統(tǒng)對于開發(fā)用于癌癥早期診斷和癌癥治療評估的單細(xì)胞生物芯片平臺具有重要意義。

從外源向細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移是一項(xiàng)基本的生物工程技術(shù)，也是表征基因結(jié)構(gòu)和功能的有力工具。目前用于裸基因轉(zhuǎn)移的被動方法包括：脂質(zhì)體介導(dǎo)法、微注射法和病毒載體轉(zhuǎn)染法等。裸基因轉(zhuǎn)移的被動方法具有無需外部供能、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，但載體，尤其是病毒載體，存在局限性和安全缺陷。雖然脂質(zhì)體、高分子材料和納米基因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等非病毒載體沒有病毒毒性或免疫原性等缺陷，但它們的傳輸效率非常低。

裸DNA轉(zhuǎn)移的主動方法包括：微注射、粒子轟擊/粒子槍、電穿孔和光學(xué)方法。微注射和粒子轟擊都是介入方法；也就是說，細(xì)胞膜必須穿孔才能將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。電穿孔基因轉(zhuǎn)移也需要細(xì)胞膜穿孔，它利用高壓電擊（10–20kV/cm）將DNA質(zhì)粒通過細(xì)胞膜后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。目前，電穿孔是最常用的一種方法，因?yàn)殡姶┛拙哂修D(zhuǎn)染效率高和適用于大型DNA質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)，但其操作需要低離子水平的培養(yǎng)基和高電壓，這可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，高聚焦激光還可用于在細(xì)胞膜上產(chǎn)生直徑約1μm的穿孔，這是光學(xué)基因轉(zhuǎn)移的原理。然而，激光束很容易損傷細(xì)胞，這大大限制了該方法的應(yīng)用。光學(xué)基因轉(zhuǎn)移特別適用于一次僅處理一個細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

圖1 超聲DNA轉(zhuǎn)移機(jī)理的示意圖

超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，也被稱為聲孔效應(yīng)，是近年來開發(fā)的一種細(xì)胞膜滲透技術(shù)，已被應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的DNA和藥物轉(zhuǎn)移。該技術(shù)基于超聲波的空化效應(yīng)。當(dāng)超聲波在液體溶液中傳播時，路徑中的液體將經(jīng)歷交替壓縮和膨脹。如果超聲強(qiáng)度足夠大，液體在壓縮和膨脹過程中會形成氣泡，并能在膨脹到一定程度后破裂。從氣泡產(chǎn)生到破裂的時間通常非常短，通常在1μs以內(nèi)。該過程被稱為超聲空化。超聲空化產(chǎn)生的局部高溫高壓沖擊波可以在細(xì)胞膜上形成有效直徑小于100nm的微孔。這些微孔可以持續(xù)幾秒鐘，讓較大的分子從培養(yǎng)基進(jìn)入細(xì)胞。在優(yōu)化的條件下，細(xì)胞可以在空化效應(yīng)下存活，且無明顯損傷?；谧孕迯?fù)機(jī)理，基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞膜可以自行橋接。以上是超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的原理。圖1顯示了超聲介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移機(jī)理和DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的典型步驟。

該技術(shù)目前被認(rèn)為是將DNA質(zhì)?；蚱无D(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的理想方法。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：（a）理論上，DNA或RNA可以被轉(zhuǎn)移到任何類型的細(xì)胞，包括細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞；（b）它不要求培養(yǎng)基是無離子的，并且可用于在自然環(huán)境或人體內(nèi)生長的細(xì)胞；（c）它是非侵入性的，不需要與細(xì)胞直接接觸；（d）人們可以很容易控制轉(zhuǎn)移的時間和位置。超聲可以被限制在特定的區(qū)域或時間段，以改善基因轉(zhuǎn)移的效果。

現(xiàn)有的超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)都是在宏觀體積下使用大型超聲設(shè)備（例如喇叭形超聲輻射器或超聲?。┻M(jìn)行的。相關(guān)研究僅在宏觀尺度（10?–10?個細(xì)胞）上進(jìn)行，并得出平均數(shù)據(jù)。由于細(xì)胞反應(yīng)的不均勻性和不同的生命或代謝周期，平均數(shù)據(jù)往往難以解讀。為了解決這個問題，需要開發(fā)單細(xì)胞操作、高精度分析和高靈敏度檢測的新技術(shù)和新裝置。有趣的是，利用微流控技術(shù)，生物芯片——“芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-a-chip）的尺寸與細(xì)胞尺寸是兼容的，適合單細(xì)胞操作。

與宏觀和大體積分析技術(shù)相比，集成生物芯片技術(shù)具有試劑消耗小、殘留物少、反應(yīng)時間短、精度高、成本效益好、一次性使用等優(yōu)點(diǎn)。微流控裝置的使用有利于細(xì)胞的分離、捕獲、定位和觀察。此外，人們可以控制附著細(xì)胞的器件表面物理和化學(xué)參數(shù)，例如局部pH值和溫度，以精確控制細(xì)胞周圍的局部環(huán)境。

圖2 微流控超聲基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)示意圖

在本論文研究中，作者們將基于柔性基底壓電薄膜的MEMS聚焦超聲換能器與微通道集成，提出了一個能夠滿足高精度分析和單細(xì)胞操作要求的微流控超聲基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心部分是一個碗形彎曲的壓電薄膜結(jié)構(gòu)，其功能是自動聚焦超聲波。低輸入電壓和功率可以在微通道局部區(qū)域獲得超過空化閾值的聲壓，以減少對細(xì)胞的損傷。他們通過有限元仿真驗(yàn)證了該系統(tǒng)的可行性，開發(fā)了MEMS超聲器件和微通道集成的微流控系統(tǒng)，成功開展了HeLa細(xì)胞的超聲基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲換能器越多，轉(zhuǎn)染率越高。

圖3（a）PI基底上自聚焦超聲換能器陣列的制備流程圖；（b）微流控轉(zhuǎn)染生物芯片。

圖4 超聲基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)示意圖

圖5 HeLa細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)結(jié)果（×200）：（a）僅添加質(zhì)粒；（b）添加質(zhì)粒并用2 號換能器超聲處理20s；（c）添加質(zhì)粒并用4號換能器超聲處理20s；（d）添加質(zhì)粒并用2號和4號換能器同時超聲處理20s。

審核編輯：郭婷