免疫系統(tǒng)的老化驅(qū)動系統(tǒng)性老化和與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)病機制（如阿爾茨海默?。?。但是由于體外研究的有限性，在理解免疫驅(qū)動的衰老，尤其是大腦衰老方面，仍然存在重大的知識空白。因此，研發(fā)神經(jīng)-免疫相互作用的優(yōu)良模型顯得尤其重要。

來自哈佛醫(yī)學院的Luke P. Lee教授課題組與印第安納大學布明頓分校的郭峰課題組合作，通過3D打印開發(fā)了人腦類器官微生理分析平臺（Microphysiological analysis platform，MAP），可動態(tài)監(jiān)測免疫驅(qū)動大腦衰老過程，該工作以題為“Understanding Immune-Driven Brain Aging by Human Brain Organoid Microphysiological Analysis Platform”的研究報告于近期刊登在Advanced Science上。

構(gòu)建人腦類器官微生理分析平臺（MAP）了解免疫驅(qū)動的大腦衰老

為了解免疫驅(qū)動的腦衰老過程，研究人員開發(fā)了人腦類器官MAP，從老年和年輕的供體分離單核細胞（圖1a），和人腦類器官相互作用，來模擬免疫驅(qū)動的大腦衰老。MAP有2個部分組成（圖1b、c）：1）一個中空的網(wǎng)狀管狀可灌注支架，與兩個介質(zhì)容器相連，用于支持類器官沿管狀支架表面生長，灌注氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，并模擬免疫細胞（例如單核細胞）在血管中流向類器官；2）薄玻璃蓋玻片上的有機體支架，用于將有機體固定在孔板內(nèi)。發(fā)育中的類器官可以在管狀可灌注支架和類器官支架之間的有限空間內(nèi)（400μm內(nèi)）長成煎餅狀結(jié)構(gòu)。一旦與搖擺流相結(jié)合，MAP可最大限度地減少玻片上培養(yǎng)的類器官的壞死和缺氧，進而促進免疫細胞的無創(chuàng)流入，實現(xiàn)動態(tài)觀察免疫細胞-類器官相互作用的延時成像（圖1d）。

圖1 構(gòu)建人腦類器官微生理分析平臺（MAP）了解免疫驅(qū)動的大腦衰老

芯片上構(gòu)建人腦皮質(zhì)類器官的可灌注培養(yǎng)

在MAP應用于人腦類器官培養(yǎng)之前，首先生成并優(yōu)化了在芯片上培養(yǎng)人腦皮質(zhì)類器官。通過模擬，描述了MAP裝置內(nèi)的3D分布圖（圖2a左）和側(cè)視圖（圖2a右）（搖擺角=15，搖擺頻率=0.1rpm）。進一步測量了流速對搖擺角的依賴性（圖2b中的點，搖擺頻率=0.1rpm），這與模擬結(jié)果相匹配（圖2b中的紅色虛線）。該研究采用了一種在芯片上生成和培養(yǎng)人腦皮質(zhì)類器官（human cortical organoids，hCO）的方案（圖2c）。具體來說，用SB-431542和XAV-939將人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells ，hESC）組裝為直徑約300μm的胚胎體（embryonic bodies，EBs），通過抑制TGF和Wnt/β-catenin信號傳導來誘導神經(jīng)和形成圖像。在第9天將EB轉(zhuǎn)移到孔板內(nèi)的類器官支架上，原位嵌入Matrigel中，并在裝置內(nèi)培養(yǎng)15天，直到形成圍繞網(wǎng)狀管狀支架形成的中空結(jié)構(gòu)（圖2d）。培養(yǎng)基中添加多種生長因子，如BDNF、EGF或FGF，用于誘導神經(jīng)元分化、成熟和存活。在第24天，孔板內(nèi)的裝置被轉(zhuǎn)移到搖擺平臺以產(chǎn)生內(nèi)腔流體流動，同時添加抗壞血酸和cAMP，以支持神經(jīng)祖細胞分化為成熟神經(jīng)元、類器官生長。

圖2 芯片上人腦類皮質(zhì)類器官的培養(yǎng)

人腦類器官MAP表征

使用活力測定、免疫熒光染色和RNA-Seq方法描述了芯片上培養(yǎng)的hCOs。通過檢測第9、16、24天芯片上培養(yǎng)的hCO細胞活力，發(fā)現(xiàn)其保持非常高的活力（圖3a）。使用PAX6（神經(jīng)祖細胞）和MAP2（神經(jīng)元）進行免疫熒光染色，確認hCOs可正確發(fā)育和分化（圖2b）。RNA-Seq結(jié)果提示芯片上培養(yǎng)的hCO具有前腦的轉(zhuǎn)錄譜特征（圖2c、d、e）。總體而言，這些結(jié)果表明，MAP系統(tǒng)可以促進hCO中的前腦命運承諾、神經(jīng)元和突觸的成熟。

圖3 芯片上培養(yǎng)的類器官表征

使用人腦類器官MAP系統(tǒng)研究單核細胞可浸潤類器官

在老年的大腦中，單核細胞在受傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病期間可通過腦血屏障（Brain-blood barrier，BBB），在大腦中浸潤增加。動物實驗表明，老年小鼠在受傷/慢性炎癥中CCR2+的單核細胞浸潤增加，可能是基于MCP1/CCR2趨化性信號進入大腦，進而誘導炎癥。為了研究年輕和老年的單核細胞對hCOs的浸潤能力，分離年輕和老年供體的外周血單核細胞灌注到芯片上培養(yǎng)的hCOs中。免疫熒光檢測單核細胞（圖3a），發(fā)現(xiàn)24小時后老年的單核細胞浸潤細胞數(shù)是年輕的3倍（圖4b），浸潤深度更高（圖4c），表明老年的單核細胞滲透能力明顯高于年輕的單核細胞。將老年單核細胞和年輕單核細胞分別與類器官共培養(yǎng)后，用ELISA檢測培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)MCP-3在老年單核細胞和類器官共培養(yǎng)上清中顯著上調(diào)（圖4d）。利用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)MCP-3在老年單核細胞和類器官共培養(yǎng)細胞中顯著上調(diào)（圖4e）。這表明老年的單核細胞浸潤能力增加可能歸因于MCP1/MCP3/CCR2信號軸，根據(jù)文獻推測這可能是由hCOs中活化的星形膠質(zhì)細胞分泌的。

圖4 單核細胞浸潤人腦類器官的表征

使用人腦類器官MAP系統(tǒng)研究單核細胞驅(qū)動的腦衰老

細胞衰老、神經(jīng)元凋亡是大腦衰老的標志。通過鈣染料（Cal520，綠色）對hCO的神經(jīng)元進行染色，發(fā)現(xiàn)老年組中的神經(jīng)元顯示出凋亡形態(tài)（圖5a）。通過對芯片上共培養(yǎng)的單核細胞和hCO的qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)前列腺素E2（PGE2）、COX-2和TNF-α顯著上調(diào)（圖5b），它們是與年齡相關(guān)巨噬細胞相關(guān)的促炎基因，也是星形膠質(zhì)細胞活化的指標。通過分析促炎細胞因子，進一步證實了老年的單核細胞在hCOs中誘導出促炎反應（IL-1-β、TNF-α均升高）（圖5c）。還發(fā)現(xiàn)在老年的單核細胞+hCOs組中，p16和p21等衰老相關(guān)標志物的表達顯著升高。這些結(jié)果表明，來自老年人的浸潤單核細胞在hCOs中誘導出促炎反應并促進腦老化。

圖5 單核細胞驅(qū)動的大腦衰老的表型表征

利用MAP這個系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)從老年人身上分離出的單核細胞可以對年輕的大腦類器官產(chǎn)生獨特的衰老表型。此外，浸潤的衰老單核細胞周圍的神經(jīng)元也表現(xiàn)出凋亡形態(tài)，進一步支持了衰老的外周免疫系統(tǒng)可能導致大腦衰老的假設。目前的MAP模型的一個限制是類器官來自具有長端粒的人類胚胎干細胞，這些端粒不能反映衰老大腦的衰老表型?？傊?，該研究揭示了一種無需外部基因操作即可在hCO內(nèi)誘導衰老表型的新的潛在方法，為研究免疫驅(qū)動的大腦衰老以及恢復衰老大腦的穩(wěn)態(tài)提供了新的研究途徑。