想象一下，如果我們身體里的細(xì)胞無法全部打亂成均勻分布會怎樣？實(shí)際上，在那種情況下，基本已經(jīng)只能算是一個巨型的多細(xì)胞團(tuán)了，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)，只有各種不同的細(xì)胞能夠被精確的分選定位，才能形成一個具有多功能分區(qū)且能夠執(zhí)行正常生理活動的生物有機(jī)體。

類似的問題如果放到人工研究體系，也是殊途同歸，比如近年來發(fā)展的液滴微流控是一種強(qiáng)大的技術(shù)平臺，可用于多種生物學(xué)應(yīng)用，包括單細(xì)胞遺傳學(xué)、抗體發(fā)現(xiàn)和定向進(jìn)化，但要想篩選在化學(xué)組成上不同的液滴目前仍面臨困難。可事實(shí)上，在化學(xué)成分不同的液滴中進(jìn)行以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物化學(xué)分析具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其是在減少樣品量、成本以及提高產(chǎn)量等方面。此外，根據(jù)所需特征對不同組分液滴進(jìn)行分類的能力十分關(guān)鍵，特別是在分離生物或化學(xué)篩選的命中，如可溶性細(xì)胞產(chǎn)物如抗體的篩選以及藥物的篩選等。因此，按需分選生產(chǎn)具有不同化學(xué)組成的液滴對基礎(chǔ)和臨床研究都具有重大意義。

新方法&新平臺

近日，來自歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Christoph A. Merten教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種升級版的微流控技術(shù)平臺（micro?uidic Braille valve platform，簡稱Braille Display，BD），用于按需生成具有不同化學(xué)成分（16種不同試劑及其組合）的液滴，并且能根據(jù)熒光信號對具有不同化學(xué)性質(zhì)的液滴進(jìn)行分選。該技術(shù)平臺結(jié)構(gòu)緊湊、功能多樣，并且成本效益較高。在應(yīng)用測試方面，這一新型微流控技術(shù)平臺成功完成了針對74種情況篩選癌細(xì)胞藥物敏感性的全過程，且能夠根據(jù)酶活性對不同的液滴進(jìn)行分類。

圖1?微流控技術(shù)集成平臺用于藥物篩選和液滴分選

平臺搭建

研究人員首先對芯片構(gòu)造進(jìn)行了設(shè)計(jì)。具體來看，在微流控芯片的常規(guī)基礎(chǔ)上，BD平臺采用64個針口以4×16的矩陣進(jìn)行排列，并安裝控制器用于驅(qū)動，以打開和關(guān)閉上述芯片上的微閥，從而可以控制和混合16種注入溶液或在微通道中分選液滴（每個分選通道僅使用4個針口）。

圖2?總體芯片以及組合控制生產(chǎn)示意圖

系統(tǒng)配備

將芯片平臺建造好后，則需要定制設(shè)定靈活的軟件控制系統(tǒng)，來實(shí)現(xiàn)多樣的功能，充分發(fā)揮BD的強(qiáng)大性能。為了充分適配和發(fā)揮平臺的多樣功能，研究人員共設(shè)計(jì)了12種應(yīng)用程序用于實(shí)現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，例如?yīng)用程序A：藥物篩選型，其中還包括數(shù)據(jù)分析的詳細(xì)信息；以及應(yīng)用程序B：液滴分選型，包括分選芯片的制備、實(shí)驗(yàn)設(shè)置和數(shù)據(jù)評估。

圖3?分析方法的工作流程示意圖

應(yīng)用示例

（1）組合藥物篩選 在進(jìn)行組合藥物篩選時，主要分為三個步驟：（i）藥物和對照品的制備；（ii）編碼;（iii）BD上的芯片對接。對于該研究設(shè)計(jì)的平臺，體系優(yōu)化后選擇在每個樣本約100個細(xì)胞的群體水平上進(jìn)行分析，從而可以保障更多的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，提高藥物反應(yīng)。然而，從細(xì)胞群體水平來看，只有最有效的藥物或藥物組合才能被識別，而單個耐藥克隆可能無法分析到。因此，BD平臺也被用于生成具有不同化學(xué)成分的單細(xì)胞液滴（每個受試藥物約250個重復(fù)組），從而實(shí)現(xiàn)對單個耐藥克隆的識別。然而，需要注意的是，單細(xì)胞液滴形式阻止了幾乎所有類型的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，因而可能導(dǎo)致藥物敏感性的改變，可以根據(jù)自己的具體應(yīng)用和科學(xué)問題選擇分析模式，或者是進(jìn)行兩種模式的混合篩選。

圖4?組合藥物篩選的實(shí)驗(yàn)裝置及過程

（2）液滴篩選

BD技術(shù)的另一個應(yīng)用是其用于化學(xué)上不同的液滴進(jìn)行分類篩選。該研究首先采用了基于熒光的條形編碼策略，只要樣品保持在連續(xù)微流陣列中，這些熒光編碼策略就可用于明確標(biāo)記所有的液滴。此外，研究進(jìn)一步通過在封裝前用抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色來確定每個栓塞的相對細(xì)胞數(shù)，以提高微流體篩網(wǎng)的可靠性。所使用的抗體可以與生物酶偶聯(lián)，該酶可以將安培紅（Amplex Red）轉(zhuǎn)化為試鹵靈（resorufin），產(chǎn)生紅色熒光達(dá)到對液滴的標(biāo)記。

研究通過試驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了基于圖像分析的液滴、細(xì)胞和果蠅胚胎分選。此外，該平臺可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)多達(dá)八種方式的分選模式，與常規(guī)的二元熒光強(qiáng)度不同，八向排序可以實(shí)現(xiàn)更細(xì)微的差異研究，如通過將液滴收集到不同強(qiáng)度的“箱”中并進(jìn)行下游分析，可以研究目標(biāo)群體中的熒光強(qiáng)度梯度。因此，BD分選集成的平臺不僅可以分析不同藥物處理對樣本的影響，還可以物理分離感興趣的特定樣本群進(jìn)行下游分析（例如，成像和測序）。

圖5?根據(jù)酶活性對液滴進(jìn)行分類

平臺優(yōu)勢及應(yīng)用總結(jié)

綜合效率和應(yīng)用潛力進(jìn)行分析，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，該集成型BD微流控平臺的主要優(yōu)勢則是成本低、靈活性高，可實(shí)現(xiàn)諸如聯(lián)合藥物篩選和個性化癌癥治療等不同的應(yīng)用，也可以用于進(jìn)行細(xì)胞、胚胎或液滴的多通道分選制備。該技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化包括提升微流速度已經(jīng)降低整體成本，從而應(yīng)用去其他更多的領(lǐng)域，如組合篩選用于觸發(fā)細(xì)胞命運(yùn)的最佳生長因子組合，可用于細(xì)胞分化、再生醫(yī)或出生缺陷的預(yù)防和治療等。此外，因?yàn)樵撈脚_根據(jù)自動圖像分析分離樣品進(jìn)行特異性分析，有望在基于光學(xué)顯微鏡成像的發(fā)育生物學(xué)中獲得相關(guān)應(yīng)用。