藥物篩選是藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵步驟，當(dāng)前的藥物篩選大多數(shù)是基于單一作用靶標(biāo)的單藥物篩選，靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）一旦產(chǎn)生耐藥性，針對(duì)單一作用靶標(biāo)的單一藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性就會(huì)大大削弱。

而人體疾病的產(chǎn)生和發(fā)展往往伴隨著復(fù)雜的基因通路的改變，相比于單藥物，多重藥物可以通過(guò)作用于多個(gè)通路的多個(gè)靶標(biāo)從而發(fā)揮更好的治療效果，有著可降低耐藥性和疾病復(fù)發(fā)可能性的優(yōu)勢(shì)。

然而，由于待檢測(cè)藥物組合數(shù)量巨大，并且現(xiàn)有的基于細(xì)胞形態(tài)或細(xì)胞增殖率的表型分析策略相對(duì)簡(jiǎn)單，導(dǎo)致目前已知的有效的藥物組合較少。

近期，深圳大學(xué)李自達(dá)助理教授與深圳市華大生命科學(xué)研究院劉亞副研究員合作，完成了利用單細(xì)胞測(cè)序和微液滴操控、實(shí)現(xiàn)高通量多重藥物篩選的工作。相關(guān)研究成果于近日以“Combinatorial perturbation sequencing on single cells usingmicrowell-based droplet random pairing”為題發(fā)表在Biosensors& Bioelectronics上。

該項(xiàng)工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、廣東省自然科學(xué)基金、深圳市海外高層次人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)和深圳大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)的資助。

在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用基于微孔的液滴隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的組合擾動(dòng)并測(cè)序（CP-seq），通過(guò)在組合藥物處理下的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化來(lái)表征組合藥物對(duì)單細(xì)胞的基因擾動(dòng)情況。

CP-seq利用連接了刀豆蛋白的寡核苷酸對(duì)藥物進(jìn)行編碼（圖1a），將藥物和細(xì)胞分別封裝在不同的液滴中（圖1b），在微孔陣列芯片上將細(xì)胞液滴與兩個(gè)藥物液滴隨機(jī)配對(duì)，從而完成對(duì)細(xì)胞的組合藥物處理和編碼標(biāo)記（圖1c）。

在隨后的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中可以同時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息和藥物編碼，用于解碼相應(yīng)的藥物處理?xiàng)l件（圖1d）。

圖1 CP-seq流程示意圖。（a）連接有寡核苷酸序列（藥物編碼）的刀豆蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；（b）細(xì)胞液滴的生成和藥物液滴池的生成與集合；（c）在微孔陣列上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞液滴和隨機(jī)的組合藥物液滴的捕獲、配對(duì)及融合；（d）融合后的液滴進(jìn)行回收孵育后，液滴破乳回收經(jīng)過(guò)組合藥物處理后的被標(biāo)記的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序磁珠通過(guò)poly（T）尾巴同時(shí)捕獲mRNA和藥物編碼。

對(duì)液滴的穩(wěn)定***是CP-seq技術(shù)的基礎(chǔ)。因此，研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和表征了高度穩(wěn)定的液滴微流控***性能。研究團(tuán)隊(duì)利用注射器施加負(fù)壓的方式可穩(wěn)定生成尺寸可控的包裹不同內(nèi)容物的液滴（變異系數(shù)小于5%），并且在使用8000/μL的細(xì)胞密度下有著超高的細(xì)胞液滴利用率（97.9%的細(xì)胞液滴包裹至少一個(gè)細(xì)胞）。在液滴配對(duì)過(guò)程中，藥物液滴的尺寸是一個(gè)重要的參數(shù)。例如，當(dāng)藥物液滴的直徑為50μm而不是43μm時(shí)，只有20.4%的微孔捕獲了兩個(gè)藥物液滴，77.7%的微孔捕獲了一個(gè)藥物液滴。

在液滴捕獲、配對(duì)和融合過(guò)程中，高達(dá)83%的微孔利用率表現(xiàn)出CP-seq平臺(tái)良好的微流控液滴***性能。最后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了電暈處理實(shí)現(xiàn)液滴融合的方式對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)影響的探究，通過(guò)與對(duì)照組的UMAP聚類圖比較，發(fā)現(xiàn)電暈處理對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響可忽略不計(jì)。

圖2 液滴微流控的平臺(tái)性能表征。（a-b）細(xì)胞液滴和藥物液滴的顯微圖片和直徑分布直方圖；（c）每個(gè)細(xì)胞液滴內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)的分布；（d-f）細(xì)胞液滴的捕獲、藥物液滴的捕獲和液滴融合的顯微圖片，每個(gè)過(guò)程中的微孔利用率分別為99%、92%和90%；（g）不同尺寸的藥物液滴在藥物液滴捕獲過(guò)程中的差異；（h）單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的UMAP聚類圖展示電暈處理對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響。

在驗(yàn)證CP-seq具有良好的液滴***性能后，鑒于經(jīng)過(guò)選定的藥物單獨(dú)處理后的細(xì)胞的基因表達(dá)已經(jīng)有廣泛的研究，可以作為參考的標(biāo)準(zhǔn)，因此研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)進(jìn)行單藥物處理來(lái)驗(yàn)證CP-seq的可靠性。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同孵育時(shí)間（4、8、12小時(shí)）的單藥物處理（3種不同濃度的4種藥物以及1組空白對(duì)照），研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)不同孵育時(shí)間下的細(xì)胞的基因表達(dá)具有顯著差異。

并且，隨孵育時(shí)間的提高，選定的抗癌藥物的目標(biāo)基因的表達(dá)量的變化趨勢(shì)和過(guò)往文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的一致，充分證明了CP-seq平臺(tái)在單藥物處理中的良好的可靠性。

圖3 通過(guò)單藥物處理驗(yàn)證CP-seq的可靠性。（a）用于捕獲單一藥物液滴的微孔陣列芯片，大小孔具有不同的深度；（b）捕獲了細(xì)胞液滴和單一藥物液滴的顯微圖片；（c）在0、4、8和12小時(shí)的藥物處理?xiàng)l件下，對(duì)單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制；（d）UMAP聚類散點(diǎn)圖；（e）不同孵育時(shí)間下基因表達(dá)的熱圖，每列代表相應(yīng)孵育時(shí)間下的藥物處理?xiàng)l件；（f）代表性基因在不同藥物孵育時(shí)間下的基因表達(dá)變化。

最后，研究團(tuán)隊(duì)實(shí)施CP-seq的完整流程以進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。13種藥物條件中的兩種可能的組合數(shù)量為78種。在非孵育組，共回收出71種藥物組合（圖4a），缺少的七種組合可能是在數(shù)據(jù)過(guò)濾中由于質(zhì)控不合格而被剔除。在孵育組***回收了47種藥物組合，這些組合的數(shù)量比非孵育組少，可能是由于組合藥物處理誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

研究團(tuán)隊(duì)接著通過(guò)對(duì)細(xì)胞組分的基因富集分析來(lái)得到這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞組分的差異。結(jié)果表明，未進(jìn)行孵育組中富集到的基因類別主要與細(xì)胞核中的染色體有關(guān)，其基因具有有絲分裂等功能（圖4b）。相比之下，組合藥物孵育1小時(shí)組富集的基因類別主要是核糖體和線粒體成分，可能表明高細(xì)胞正處于高度應(yīng)激狀態(tài)。

然后，研究團(tuán)隊(duì)將組合藥物處理1小時(shí)與單一藥物處理4、8、12小時(shí)的轉(zhuǎn)錄組信息做比較，并通過(guò)火山圖展示（圖4c），其中，MALAT1、NEAT1和B2M等基因的差異表達(dá)充分證明CP-seq在組合藥物處理下分析細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息的能力。

圖4 通過(guò)組合藥物處理驗(yàn)證CP-seq的可靠性。（a）和弦圖展示單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中回溯出的藥物組合情況，分為未孵育組和組合藥物孵育1小時(shí)組；（b）未孵育組和組合藥物孵育1小時(shí)組的細(xì)胞組分的基因富集分析；（c）火山圖表示組合藥物孵育一小時(shí)的細(xì)胞與單藥物孵育 4 小時(shí)、8 小時(shí)和 12 小時(shí)的差異基因表達(dá)的比較。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)中使用的載玻片大小的微孔陣列芯片大約有26800個(gè)微孔單元，每個(gè)微孔平均可容納3個(gè)細(xì)胞，在20個(gè)微孔的樣本大?。▇60個(gè)細(xì)胞）情況下，一張芯片原則上可以同時(shí)進(jìn)行1300種藥物組合的處理。除了兩種藥物的組合外，在每個(gè)微孔單元中加入額外的小微孔，CP-seq就具有適用于測(cè)試多種藥物組合的潛力。因此，利用液滴微流控在高通量篩選中的優(yōu)勢(shì)，CP-seq可以在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)試數(shù)千種藥物組合，有望成為一種用于高通量和深入分析的組合藥物篩選新技術(shù)，極大地促進(jìn)新藥物組合的發(fā)現(xiàn)。

論文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114913





審核編輯：劉清