近期，黃祖芳研究員和王靜研究員研究團(tuán)隊通過將機(jī)器學(xué)習(xí)和直接表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）檢測技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種可檢測早期肺癌與良性肺部疾病患者的全局DNA甲基化信息的方法。相比于常規(guī)的DNA甲基化表征方法，如高效液相色譜法和發(fā)光甲基化測定法，這種方法具有快速、靈敏和簡單的優(yōu)點，并且無需亞硫酸鹽處理和擴(kuò)增。這一技術(shù)有望應(yīng)用于早期肺癌的準(zhǔn)確檢測和診斷，為肺癌的早期治療提供幫助。目前，低劑量計算機(jī)斷層掃描（LDCT）仍存在區(qū)分早期肺癌與良性肺部疾病的挑戰(zhàn)，而這項研究提供了一種潛在的解決方案。

該工作以“Machine learning-assisted global DNA methylationfingerprint analysis for differentiating early-stage lung cancer from benignlung diseases”為題發(fā)表于國際權(quán)威期刊Biosensors and Bioelectronics上，福建師范大學(xué)博士研究生陸德嬋和福建省腫瘤醫(yī)院陳燕坪主任醫(yī)師為共同第一作者，福建師范大學(xué)黃祖芳研究員、盧玉棟教授和王靜研究員為共同通訊作者。

該研究開發(fā)了一種新的基于直接SERS納米技術(shù)的DNA甲基化模式檢測技術(shù)，如圖1所示。首先從福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的組織樣本中提取gDNA，然后將其與金納米粒子（AuNPs）混合進(jìn)行SERS檢測。由于甲基對AuNPs的親和力高于銀和銅納米粒子，因此選用AuNPs作為gDNA信號放大的SERS基底。該研究發(fā)現(xiàn)，5-甲基胞嘧啶的分布（即DNA甲基化模式）在早期肺癌和肺部良性疾病患者之間存在差異性，這些差異可以通過gDNA的SERS光譜反映出來。

因此，該研究團(tuán)隊利用直接SERS技術(shù)檢測了106例（包括65例早期肺癌和41例良性肺部疾病患者）FFPE的gDNA的SERS特征。通過偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）模型結(jié)合gDNA的SERS光譜特征，成功區(qū)分早期肺癌和肺部良性疾病患者。這種技術(shù)的發(fā)展有望成為一種新型的肺癌篩查方法，并為其他癌癥的早期診斷提供新思路。

圖1 基于非標(biāo)記SERS結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)區(qū)分早期肺癌和肺部良性疾病患者的示意圖

如圖2所示，研究團(tuán)隊通過檢測5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶，以及包含5-甲基胞嘧啶的合成DNA序列（mCGATAmCGmCAT，ss mC）和其未甲基化的對應(yīng)序列（CGATACGCGCAT，ss）的SERS光譜，探討了甲基化相關(guān)的特征峰。隨后，研究人員分析了這些甲基化相關(guān)特征峰（如1006/cm）與甲基化水平的關(guān)系，以此確定了與甲基化相關(guān)的光譜標(biāo)記。

圖2 （A）5-甲基胞嘧啶（5mC）和胞嘧啶（C）的SERS光譜以及5mC-C的差譜；（B）ss mC（mCGATAmCGmCGCAT，20 ng/μL）和ss（CGATACGCAT，20 ng/μL）的SERS光譜，以及ss mC-ss的差譜；（C）PLS-DA模型區(qū)分ss mC和ss的VIP分?jǐn)?shù)；（D）不同胞嘧啶堿基比例的ss mC+ss的SERS光譜，RmC=[mC]/([C]+[mC])；（E）摩爾比RmC與1001/cm處的峰強(qiáng)度（I1001）之間的線性關(guān)系。

如圖3所示，研究團(tuán)隊利用直接SERS技術(shù)分別檢測了來源于肺癌細(xì)胞系和肺上皮細(xì)胞系的DNA的SERS光譜，并比較了對應(yīng)的5-甲基胞嘧啶特征峰1006/cm的拉曼強(qiáng)度差異。通過與商業(yè)化試劑盒（LINE-1）的交叉驗證，進(jìn)一步證明直接SERS技術(shù)可以對從細(xì)胞系中提取的gDNA的全局甲基化水平提供準(zhǔn)確可靠的測量結(jié)果。

圖3（A）不同細(xì)胞系提取的gDNA的平均SERS光譜以及（B）差譜；（C）特征峰1006/cm對應(yīng)的拉曼強(qiáng)度；（D）LINE-1試劑盒檢測細(xì)胞系的全局甲基化水平

如圖4所示，研究團(tuán)隊利用直接SERS技術(shù)檢測了早期肺癌（n = 65）和肺部良性疾?。╪ = 41）患者的FFPE組織標(biāo)本中提取的gDNA的SERS光譜。基于單個譜峰（I1006）強(qiáng)度計算ROC曲線下的面積（AUC）值為0.7，表明DNA甲基化可作為潛在的區(qū)分早期肺癌和肺部良性疾病患者的生物標(biāo)志物。研究團(tuán)隊還利用PLS-DA模型對全譜光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)直接SERS檢測與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合，可以識別DNA甲基化模式的分子特征，從而提高早期肺癌和肺部良性疾病患者的診斷性能，表明這種方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 （A）每個樣本的gDNA光譜強(qiáng)度映射圖；（B）早期肺癌和肺部良性疾病患者的gDNA的平均SERS光譜以及差譜；（C）基于1006/cm的峰值強(qiáng)度的全局甲基化水平的比較；（D）基于1006/cm處的SERS信號強(qiáng)度的ROC曲線用于區(qū)分早期肺癌和肺部良性疾病患者；（E）根據(jù)PLS-DA模型計算的每個樣本的預(yù)測分?jǐn)?shù)；（F）基于預(yù)測分?jǐn)?shù)的ROC曲線，用于鑒別早期肺癌和肺部良性疾病患者；（G）PLS-DA模型中得到的用于鑒別早期肺癌和肺部良性疾病的VIP分?jǐn)?shù)。

綜上所述，在這項工作中，研究團(tuán)隊提出了一種結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)的直接SERS方法，用于分析DNA甲基化模式，探究早期肺癌和肺部良性疾病患者在分子水平上的差異。未來，便攜式光學(xué)儀器的發(fā)展將進(jìn)一步促進(jìn)床旁的DNA分析，用于早期疾病的檢測。

審核編輯：劉清