根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的數(shù)據(jù)，全球45%的疾病負(fù)擔(dān)是由生物負(fù)荷造成的。在生物制藥的生產(chǎn)中，與生物負(fù)荷有關(guān)的污染也是一個(gè)主要問題。因此，快速和準(zhǔn)確的生物負(fù)荷檢測(cè)在食品、衛(wèi)生、制藥和環(huán)境應(yīng)用中變得越來(lái)越必要。

近幾十年來(lái)，微流控技術(shù)已成為一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，并在分析化學(xué)、制藥、化學(xué)合成和臨床應(yīng)用等幾個(gè)前沿研究領(lǐng)域得到了應(yīng)用。近年來(lái)，微流控技術(shù)也被應(yīng)用于微生物研究。微流控器件具有微米級(jí)特征尺度和大規(guī)模集成的特點(diǎn)，在微生物分析和抗生素持久性研究方面具有低成本、高通量和高效率等特殊優(yōu)勢(shì)。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，一些研究利用濾紙作為捕獲和檢測(cè)細(xì)菌的手段，并且由于其低成本、易于獲取、加工和修飾，以及可拋性而變得流行。

然而，已報(bào)道的基于濾紙的微流控器件具有很高的檢測(cè)限（LOD，57 CFU/m ~ 500 CFU/mL），并且精度較低。此外，濾紙基微流控器件通常需要復(fù)雜的修飾（抗體功能化），即將納米顆粒固定化，并利用紫外線將濾紙上用于檢測(cè)的圖案光固化。同時(shí)，由于經(jīng)過(guò)特定抗體功能化，濾紙基微流控器件通常對(duì)特定細(xì)菌菌株的檢測(cè)具有特異性。這些缺點(diǎn)阻礙了快速、簡(jiǎn)便、低成本的濾紙基微流控器件在細(xì)菌檢測(cè)，特別是在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，為了準(zhǔn)確、高靈敏度地檢測(cè)生物負(fù)荷，來(lái)自美國(guó)馬里蘭大學(xué)巴爾的摩分校（University of Maryland Baltimore County）的研究人員制造了一種新型的微流控器件，該器件集成了濾紙，以用于細(xì)胞捕獲。同時(shí)，該器件利用熒光標(biāo)記的間苯二酚的氧化還原反應(yīng)在濾紙上原位檢測(cè)生物負(fù)荷，并使用便攜式多通道熒光計(jì)進(jìn)行熒光測(cè)量。此外，該微流控器件采用微波誘導(dǎo)熱輔助鍵合技術(shù)進(jìn)行制備，具有制備簡(jiǎn)便、成本低和速度快的優(yōu)勢(shì)。

圖1 （a）集成相應(yīng)厚度濾紙的微流控器件的不同層；（b）由不同組件鍵合而成的微流控器件（左）以及具有刃天青樣品的微流控器件（右）的照片

研究人員首先探索了不同材料和尺寸的濾紙，并優(yōu)化了相關(guān)參數(shù)，以獲得更高的熒光信號(hào)和實(shí)現(xiàn)更靈敏的生物負(fù)荷檢測(cè)。

圖2 匹配不同直徑圓孔的聚醚砜（PES）濾紙的熒光響應(yīng)

芽孢桿菌是一種廣泛存在的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)人類、植物和其它生物有害，并會(huì)引起嚴(yán)重的傳染病。因此，研究人員利用該微流控器件對(duì)培養(yǎng)的原代枯草芽孢桿菌樣品進(jìn)行過(guò)濾，以此驗(yàn)證并考察其性能參數(shù)。研究結(jié)果表明，與金標(biāo)準(zhǔn)熒光測(cè)量裝置分光光度計(jì)和在多通道熒光儀中的普通微流控試劑盒（C）相比，該集成濾紙的微流控試劑盒（CF）具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限（0.037 CFU/mL）。

圖3 （a）不同細(xì)菌樣品在具有集成濾紙的微流控試劑盒的熒光儀中的響應(yīng)；（b）5 CFU/mL細(xì)菌樣品在具有兩種不同微流控試劑盒的熒光儀中以及在分光光度計(jì)中的響應(yīng)

圖4 （a）不同細(xì)菌樣品在具有集成濾紙的微流控試劑盒（CF）和普通微流控試劑盒（C）的熒光儀中以及在具有96孔板的分光光度計(jì)中的熒光斜率；（b）計(jì)算出的在熒光儀中的集成濾紙的微流控試劑盒（CF）和普通微流控試劑盒（C）以及在分光光度計(jì)中的96孔板的檢測(cè)限和靈敏度

此外，該微流控器件的檢測(cè)限還可以通過(guò)增大過(guò)濾體積來(lái)提高。從圖5中可以看出，隨著微流控器件過(guò)濾體積的增大，熒光強(qiáng)度和斜率顯著增加。這種增加反過(guò)來(lái)又增強(qiáng)了帶有熒光計(jì)的微流控器件的靈敏度，如圖5b所示。

圖5 （a）不同過(guò)濾體積的5 CFU/mL的芽孢桿菌在具有微流控試劑盒的熒光儀中的響應(yīng)；（b）隨著過(guò)濾體積的增大，微流控器件靈敏度的變化

另外，利用該微流控器件和檢測(cè)方法，研究人員可以在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的樣品孵育后6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到細(xì)菌，比金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法減少了至少4倍的檢測(cè)時(shí)間。在孵育后，樣品注入的時(shí)間取決于注入體積，最快只需要一分鐘，并且可以很容易地完成。而其它細(xì)菌檢測(cè)程序，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和細(xì)菌培養(yǎng)方法，均需要一定的程序、技術(shù)準(zhǔn)備和極其清潔的操作區(qū)域，這些操作更復(fù)雜，需要訓(xùn)練有素的人員才能完成。這就是該微流控器件在檢測(cè)超低水平生物負(fù)荷上優(yōu)于其它傳統(tǒng)方法的所在。此外，該研究所開發(fā)的微流控器件的成本約為1.6美元/個(gè)，而8通道熒光計(jì)的成本約為1300美元，其成本可以通過(guò)擴(kuò)大生產(chǎn)進(jìn)一步降低，并且與傳統(tǒng)儀器相比具有成本效益。

總體而言，這種新型的微流控器件和熒光儀一起可以作為一種快速便攜式工具，用于不同應(yīng)用場(chǎng)景下的高靈敏度、準(zhǔn)確和高通量的細(xì)菌檢測(cè)。

審核編輯：劉清