PCR因其出色的靈敏度、耐受核苷酸變異的能力以及執(zhí)行多重檢測的能力而被廣泛認為是核酸檢測（Nucleic acid testing，NAAT）的金標準。超快速PCR系統(tǒng)的開發(fā)需要使用精密的儀器。為了促進即時檢測（POCT）應(yīng)用的快速PCR，微流控技術(shù)因其在試劑分配、減少反應(yīng)體積、自動化的方面的優(yōu)勢而得到了廣泛的研究。其中，基于介電潤濕（Electrowetting-on-dielectric，EWOD）的數(shù)字微流控（Digitalmicrofluidics，DMF）可實現(xiàn)單個液滴精準操控，其高度可配置化有望實現(xiàn)在芯片實驗室應(yīng)用中開發(fā)高效的工作流程。然而，基于EWOD的數(shù)字微流控系統(tǒng)在實現(xiàn)PCR熱循環(huán)中在高溫下容易形成氣泡。

此外，液滴在熱區(qū)之間的快速和頻繁移動會導(dǎo)致介電質(zhì)擊穿（dielectric breakdown），在超快速的熱循環(huán)反應(yīng)中溫度傳感器對液滴溫度傳感的不準確，這些都可能損害EWOD PCR的耐用性。這些技術(shù)挑戰(zhàn)阻礙了EWOD應(yīng)用于現(xiàn)場診斷的即時快速PCR。

近期，澳門大學賈艷偉教授課題組報道了一種基于介電潤濕數(shù)字微流控平臺的超快速PCR，采用雙層加熱、多孔超疏水膜、隔溫槽、可溶性化學溫度傳感器等技術(shù)，綜合解決了介電潤濕數(shù)字微流控系統(tǒng)進行PCR熱循環(huán)的穩(wěn)定性問題，使得PCR在3.7 ~ 5分鐘內(nèi)完成40個熱循環(huán)，并與傳統(tǒng)PCR靈敏度相當。相關(guān)成果以“Sub-5-Minute Ultrafast PCR using Digital Microfluidics”為題發(fā)表在國際學術(shù)雜志Biosensors and Bioelectronics上。

具體而言，在該研究中，研究團隊開發(fā)了一個集成的EWOD數(shù)字微流控PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)解決了基于EWOD平臺上快速PCR的穩(wěn)定性問題。系統(tǒng)原理及結(jié)構(gòu)圖如圖1（a）所示。該EWOD PCR系統(tǒng)采用介電潤濕介導(dǎo)的液滴在不同溫區(qū)之間以移動的方式來完成PCR熱循環(huán)。

由于液滴在不斷快速移動中完成PCR熱循環(huán)，常規(guī)溫度傳感器不適用于檢測移動液滴中的溫度，另外，傳感器與液滴實際溫度之間的溫度偏差容易導(dǎo)致芯片上PCR效率降低。因此，研究團隊采用一種可溶性溫度傳感器（磺酰羅丹明B）來進行精確的液滴內(nèi)溫度校準和調(diào)控，以實現(xiàn)高效的芯片上EWOD PCR。高溫變性溫區(qū)采用頂部和底部雙層加熱方式，減少了液滴的垂直溫度差，以確保液滴PCR的穩(wěn)定性和準確性。

為了有效地消除高溫引起的介電擊穿和氣泡的產(chǎn)生，研究團隊采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作為介電層來保護電極在高溫下不被擊穿。多孔膨體PTFE（expanded PTFE，ePTFE）覆蓋在半固化的PDMS上作為疏水層，由于其多孔的可膨化特性，不容易因高溫下的熱膨脹而破裂，從而消除了因表面疏水層損傷而產(chǎn)生的氣泡。

為了加快液滴PCR的反應(yīng)速度，在頂部高溫薄膜加熱器的周圍設(shè)置了隔熱槽（Thermal isolation groove，TIG）（見圖1（b）），使得變性和退火/延伸兩個溫度區(qū)的水平溫度差增大，顯著減少了兩區(qū)之間的PCR液滴穿梭移動距離。最后，一種新型的移動電極聯(lián)鎖排列（Interlockingconfiguration）降低了移動電極對液滴大小的限制，使得大于0.2 μL大小的液滴可以在大于30°C的溫度差下連續(xù)移動，不受熱毛細管效應(yīng)的影響阻礙液滴向高溫區(qū)移動。

圖1 基于介電潤濕數(shù)字微流控的超快速PCR系統(tǒng)原理圖

以上技術(shù)確保了PCR液滴在準確控溫的不同溫區(qū)穩(wěn)定移動以進行熱循環(huán)，使得所開發(fā)的集成EWOD數(shù)字微流控系統(tǒng)在3.7 min內(nèi)實現(xiàn)了40個循環(huán)的超快PCR。此外，對一種可逆的熱啟動試劑的應(yīng)用（ThermaStopTM）消除了芯片上PCR的非特異擴增。連續(xù)梯度稀釋實驗（Serial dilutions）驗證了EWOD超快速PCR靈敏度與傳統(tǒng)PCR一致，其效率達到95.31%。



圖2 基于數(shù)字微流控的芯片上PCR

綜上所述，該研究介紹了一種基于EWOD數(shù)字微流控的穩(wěn)健的超快速PCR系統(tǒng)。該研究采用的新材料及技術(shù)的組合有效增強了EWOD芯片的耐用性，可在超過30°C的溫度梯度上至少實現(xiàn)240個液滴穿梭。體積為0.6 μL 的超快EWOD PCR在3.7 ~ 5.0分鐘可實現(xiàn)40個熱循環(huán)。比傳統(tǒng)的PCR方法加速10 ~ 17倍。此EWOD系統(tǒng)還為NAAT用于檢測傳染性病原體、耐藥性分子檢測、法醫(yī)學和其他基于PCR的實際應(yīng)用提供了可能性。

審核編輯：劉清