微流控技術(shù)是一種通過微小的通道和微型裝置對(duì)流體進(jìn)行精確操控和分析的技術(shù)，它是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展過程中的一種重要的生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和重要性，它在高通量分析、個(gè)性化醫(yī)療、細(xì)胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領(lǐng)域研究成果，一起接著往下看吧~

在肌肉組織中，當(dāng)線粒體DNA異質(zhì)性超過一定水平或者線粒體功能失調(diào)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較少的三磷酸腺苷（ATP）和過多的活性氧（ROS），這會(huì)引發(fā)肌肉的萎縮、無力和耐力喪失。因此，研究如何恢復(fù)或改善線粒體功能以促進(jìn)肌肉再生是一個(gè)有吸引力的課題。

線粒體轉(zhuǎn)移是在各種病理?xiàng)l件下恢復(fù)受損細(xì)胞的自發(fā)過程。在給藥之前將線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞治療產(chǎn)品中可以提高治療效果。然而，先前報(bào)道的線粒體轉(zhuǎn)移方法效率低，限制了它們的臨床應(yīng)用。

為了克服這些挑戰(zhàn)，香港城市大學(xué)孫東教授團(tuán)隊(duì)提出了一種基于液滴微流控的線粒體轉(zhuǎn)移技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)高效、高通量的線粒體定量轉(zhuǎn)移至單細(xì)胞。該技術(shù)結(jié)合了共培養(yǎng)和液滴微流控的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)肌肉再生有較好的治療作用。相關(guān)工作以“High-efficiency quantitative control of mitochondrial transfer based on droplet microfluidics and its application on muscle regeneration”為題，于2022年8月17日發(fā)表在《Science Advances》上。

1.基于液滴微流控的線粒體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

研究者開發(fā)的基于液滴微流控的線粒體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由三個(gè)模塊組成：液滴生成模塊、液滴觀察模塊和液滴收集模塊。

本系統(tǒng)采用流動(dòng)聚焦結(jié)構(gòu)將線粒體受體C2C12細(xì)胞懸液和分離的線粒體懸液這兩種懸浮液分離成液滴，波浪狀結(jié)構(gòu)用于增加單細(xì)胞封裝率，同時(shí)降低多細(xì)胞封裝率，提高封裝效率。（圖1）

圖1系統(tǒng)安裝示意圖、基于液滴微流控的線粒體轉(zhuǎn)移技術(shù)的工作流程和實(shí)驗(yàn)評(píng)估

從圖2觀察到，線粒體受體細(xì)胞C2C12和新鮮分離的線粒體加載到微流控芯片中進(jìn)行封裝和線粒體轉(zhuǎn)移的過程。在產(chǎn)生的液滴中共培養(yǎng)2小時(shí)后，分離的線粒體通過內(nèi)吞作用被受體細(xì)胞吸收。

通過波浪狀結(jié)構(gòu)，封裝效率提高到超過泊松分布，單細(xì)胞封裝效率可達(dá)到約47.8％，而多細(xì)胞封裝率被抑制至約5.9％。線粒體轉(zhuǎn)移效率，隨著液滴直徑的增加而略微下降，但均在70%以上。使用本線粒體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行處理后，受體細(xì)胞的存活率仍然可以保持相對(duì)較高。

圖2基于液滴微流控的線粒體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)展示

3.高效定量線粒體轉(zhuǎn)移

液滴的封閉微環(huán)境限制了分離的線粒體的移動(dòng)距離，增加了分離的線粒體接觸細(xì)胞的概率。而轉(zhuǎn)移到液滴細(xì)胞中的線粒體數(shù)量可以通過調(diào)整線粒體懸浮液的濃度來控制，從而可以對(duì)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行定量控制。

在本研究中，研究者使用了三種不同濃度的分離線粒體懸浮液來驗(yàn)證所提出系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移效率。隨著濃度的增加，線粒體轉(zhuǎn)移效率略微上升。通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和3D重建。（圖3）

圖3采用所提出的基于液滴的方法對(duì)線粒體轉(zhuǎn)移進(jìn)行定量控制

4.線粒體轉(zhuǎn)移促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖和成肌分化的體外研究

研究者通過肌生成測(cè)定，來測(cè)試C2C12成肌細(xì)胞在使用本技術(shù)進(jìn)行線粒體轉(zhuǎn)移后的分化能力。結(jié)果表明，高線粒體轉(zhuǎn)移組ATP水平和mtDNA含量顯著增加。（圖4）

圖4線粒體轉(zhuǎn)移對(duì)C2C12成肌細(xì)胞成肌分化作用的體外研究

通過qPCR分析肌肉再生相關(guān)基因的表達(dá)水平。除磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）外，其他標(biāo)志物均以濃度依賴性方式在線粒體轉(zhuǎn)移時(shí)顯示出表達(dá)上調(diào)。特別的是，轉(zhuǎn)移的線粒體過少或過多都不能促進(jìn)Pgk1的表達(dá)，這一現(xiàn)象進(jìn)一步表明了定量控制線粒體轉(zhuǎn)移在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的重要性。（圖5）

上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高線粒體轉(zhuǎn)移細(xì)胞（31個(gè)/每細(xì)胞），可以明顯增強(qiáng)成肌分化和ATP的產(chǎn)生能力?；诖?，研究者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用高線粒體轉(zhuǎn)移細(xì)胞來研究細(xì)胞療法治療的功能結(jié)果和劑量效應(yīng)。

圖5線粒體轉(zhuǎn)移后C2C12細(xì)胞在成肌分化過程中的肌源性因子和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)情況

6.肌內(nèi)注射線粒體轉(zhuǎn)移的C2C12以改善肌肉愈合質(zhì)量和功能

研究者通過小鼠肌肉損傷模型，來評(píng)估該技術(shù)的肌肉再生效果。沒有線粒體轉(zhuǎn)移的成肌細(xì)胞移植不足以促進(jìn)受傷肌肉的愈合過程，注射高劑量細(xì)胞后可能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而注射低劑量線粒體轉(zhuǎn)移的C2C12細(xì)胞（LH組）獲得本研究中最令人滿意的愈合結(jié)果。（圖6）

圖6體內(nèi)研究線粒體轉(zhuǎn)移的C2C12注射對(duì)肌肉再生的影響

基因分析結(jié)果同樣證明，LH的表達(dá)上調(diào)最高，這與功能評(píng)估中的最佳愈合結(jié)果一致。（圖7）

圖7C2C12細(xì)胞注射后肌肉損傷小鼠的肌源性因子和線粒體代謝基因表達(dá)水平

ATA-7030高壓放大器

帶寬：（-3dB）DC~5kHz

電壓：6kVp-p（±3kVp）

電流：30mAp

功率：90Wp

壓擺率：≥67V/μs

可程控

審核編輯 黃宇