熒光檢測(cè)器是一種常用的生物化學(xué)分析儀器，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等生物分子的定量、定性和定位分析。熒光檢測(cè)器的工作原理是利用熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下吸收光能，然后以較長(zhǎng)波長(zhǎng)的形式釋放出來(lái)，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度來(lái)分析樣品的濃度和性質(zhì)。熒光檢測(cè)器的性能和準(zhǔn)確性很大程度上取決于激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的設(shè)置。

一、熒光檢測(cè)器的基本原理

熒光檢測(cè)器的基本原理是利用熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下吸收光能，然后以較長(zhǎng)波長(zhǎng)的形式釋放出來(lái)。熒光物質(zhì)在吸收光能后，會(huì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后在極短的時(shí)間內(nèi)（通常為納秒級(jí)別）以熒光的形式釋放出多余的能量，回到基態(tài)。熒光的波長(zhǎng)通常比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)，這種現(xiàn)象稱為斯托克斯位移。

熒光檢測(cè)器主要由光源、樣品池、濾光片、光電倍增管等部分組成。光源提供激發(fā)光，樣品池中放置待測(cè)樣品，濾光片用于分離激發(fā)光和熒光，光電倍增管用于檢測(cè)熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。

二、熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)

熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是熒光檢測(cè)中最重要的參數(shù)之一。激發(fā)波長(zhǎng)是指熒光物質(zhì)吸收光能的波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)是指熒光物質(zhì)釋放熒光的波長(zhǎng)。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇直接影響熒光檢測(cè)的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性。

1. 激發(fā)波長(zhǎng)的選擇

激發(fā)波長(zhǎng)的選擇主要取決于熒光物質(zhì)的吸收光譜。熒光物質(zhì)的吸收光譜通常呈現(xiàn)為一個(gè)或多個(gè)吸收峰，這些吸收峰對(duì)應(yīng)于熒光物質(zhì)分子中的電子躍遷。激發(fā)波長(zhǎng)應(yīng)選擇在熒光物質(zhì)的吸收峰附近，以獲得最大的熒光強(qiáng)度。

激發(fā)波長(zhǎng)的選擇還應(yīng)考慮光源的光譜特性。不同的光源具有不同的光譜特性，如氙燈、汞燈、LED等。選擇激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)選擇光源的光譜范圍內(nèi)的波長(zhǎng)，以充分利用光源的能量。

2. 發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

發(fā)射波長(zhǎng)的選擇主要取決于熒光物質(zhì)的熒光光譜。熒光光譜通常呈現(xiàn)為一個(gè)或多個(gè)熒光峰，這些熒光峰對(duì)應(yīng)于熒光物質(zhì)分子中的電子躍遷。發(fā)射波長(zhǎng)應(yīng)選擇在熒光峰的紅移區(qū)域，以獲得最大的熒光強(qiáng)度。

發(fā)射波長(zhǎng)的選擇還應(yīng)考慮濾光片的光譜特性。濾光片用于分離激發(fā)光和熒光，通常由干涉濾光片或長(zhǎng)通濾光片組成。發(fā)射波長(zhǎng)應(yīng)選擇在濾光片的透過(guò)范圍內(nèi)，以確保熒光信號(hào)的準(zhǔn)確檢測(cè)。

三、熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的設(shè)置方法

1. 熒光物質(zhì)的選擇

選擇合適的熒光物質(zhì)是熒光檢測(cè)的第一步。熒光物質(zhì)應(yīng)具有較高的熒光量子產(chǎn)率、較低的光漂白性和較好的化學(xué)穩(wěn)定性。熒光物質(zhì)的選擇應(yīng)根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)和分析目的來(lái)確定。

2. 熒光物質(zhì)的濃度和純度

熒光物質(zhì)的濃度和純度直接影響熒光檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。熒光物質(zhì)的濃度應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，以避免熒光飽和和自吸收現(xiàn)象。熒光物質(zhì)的純度應(yīng)盡可能高，以減少雜質(zhì)對(duì)熒光信號(hào)的干擾。

3. 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的測(cè)定

熒光物質(zhì)的吸收光譜和熒光光譜是確定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的基礎(chǔ)。通過(guò)測(cè)定熒光物質(zhì)的吸收光譜和熒光光譜，可以確定熒光物質(zhì)的吸收峰和熒光峰，從而選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

4. 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的優(yōu)化

激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的優(yōu)化是提高熒光檢測(cè)性能的關(guān)鍵。通過(guò)調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，可以優(yōu)化熒光檢測(cè)的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性。優(yōu)化方法包括：

（1）改變激發(fā)波長(zhǎng)：通過(guò)改變激發(fā)波長(zhǎng)，可以改變熒光強(qiáng)度和熒光背景。在熒光物質(zhì)的吸收峰附近，熒光強(qiáng)度最大；遠(yuǎn)離吸收峰，熒光強(qiáng)度逐漸減小。通過(guò)調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)，可以找到最佳的激發(fā)波長(zhǎng)，以獲得最大的熒光強(qiáng)度和最小的熒光背景。

（2）改變發(fā)射波長(zhǎng)：通過(guò)改變發(fā)射波長(zhǎng)，可以改變熒光信號(hào)和噪聲。在熒光峰的紅移區(qū)域，熒光信號(hào)最強(qiáng)；遠(yuǎn)離熒光峰，熒光信號(hào)逐漸減小。通過(guò)調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)，可以找到最佳的發(fā)射波長(zhǎng)，以獲得最大的熒光信號(hào)和最小的噪聲。

（3）使用濾光片：濾光片可以有效地分離激發(fā)光和熒光，提高熒光檢測(cè)的選擇性。通過(guò)選擇合適的濾光片，可以進(jìn)一步優(yōu)化激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，提高熒光檢測(cè)的性能。