流式細(xì)胞術(shù)是一種廣泛而強(qiáng)大的技術(shù)，其分辨率取決于其準(zhǔn)確區(qū)分熒光陽性人群和陰性人群的能力。然而，在進(jìn)行常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)的測量時(shí)，大多數(shù)信息豐富的結(jié)果都被丟棄了，例如未純化生物樣本中標(biāo)記的外泌體的細(xì)胞大小、形狀、形態(tài)和分布或位置。在此，我們提出了一種使用具有各向異性特征的抗衍射光片來激發(fā)熒光標(biāo)簽的新方法。由抗衍射貝塞爾-高斯光束陣列組成，光片為12μm長，12μm高，厚度約為0.8μm。因此，激發(fā)熒光信號(hào)的強(qiáng)度分布可以反映尺寸，并允許樣品在0至10μm通過微流控芯片中的流體動(dòng)力學(xué)聚焦進(jìn)行運(yùn)輸。采樣率為500 kHz，在不犧牲空間分辨率的情況下提供高吞吐量的能力。因此，所提出的抗衍射光片流式細(xì)胞術(shù)（ADLSFC）可以獲得比傳統(tǒng)方法更具信息量的結(jié)果，并且能夠提供多種特征，有助于將目標(biāo)樣品與復(fù)雜背景區(qū)分開。
流式細(xì)胞術(shù)（FC）是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，能夠快速分析流過單個(gè)或多個(gè)激光截距點(diǎn)的溶液中的細(xì)胞和顆粒。由于其計(jì)數(shù)、表征和分類細(xì)胞的能力，它已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分析和疾病診斷。
在過去的三十年里，世界各地的幾個(gè)研究小組參與了微流控流式細(xì)胞術(shù)的研究。已經(jīng)開發(fā)了各種類型的流式細(xì)胞儀，包括聲聚焦細(xì)胞儀、細(xì)胞分選儀、成像細(xì)胞儀、質(zhì)量細(xì)胞儀和用于珠陣列分析的細(xì)胞儀。聲聚焦細(xì)胞術(shù)使用超聲波來幫助聚焦細(xì)胞進(jìn)行激光詢問。優(yōu)點(diǎn)是它不需要高速或大體積的鞘流。然而，它的吞吐量低，設(shè)備復(fù)雜龐大。細(xì)胞分選機(jī)通過液體樣品流的高頻振蕩產(chǎn)生液滴來分離細(xì)胞。然后，液滴被賦予正電荷或負(fù)電荷，并穿過金屬偏轉(zhuǎn)板。最終，它們會(huì)根據(jù)電荷被引導(dǎo)到特定的收集容器。細(xì)胞分選機(jī)具有高分離純度和靈活性，但它沒有樣本詳細(xì)信息。
結(jié)合熒光顯微鏡，成像流式細(xì)胞術(shù)（IFC）允許在單細(xì)胞水平上快速分析生物樣本的形態(tài)和多參數(shù)熒光，而IFC的高空間分辨率只能通過犧牲吞吐量來實(shí)現(xiàn)，即每秒分析的生物樣本數(shù)量。例如，使用電荷耦合器件（CCD）對(duì)一個(gè)細(xì)胞成像所需的時(shí)間跨度可以短至1ms，這意味著最大吞吐量僅為每秒1000個(gè)細(xì)胞。此外，IFC需要較大的存儲(chǔ)空間，分析時(shí)間較長。
質(zhì)譜儀結(jié)合了飛行時(shí)間質(zhì)譜和流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞用重金屬離子標(biāo)記的抗體（通常來自鑭系元素家族）而不是熒光抗體標(biāo)記，并使用飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測。由于不使用熒光標(biāo)記，因此不需要光補(bǔ)償。然而，樣本細(xì)胞被破壞，無法在下游進(jìn)行分析。使用細(xì)胞儀進(jìn)行珠陣列分析是一種檢測特異性結(jié)合到樣品上的熒光珠的技術(shù)。通過評(píng)估熒光強(qiáng)度，可以量化與珠子相關(guān)的樣品數(shù)量。
傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)通?！绑w積龐大”，分離純度相對(duì)較低[1]。隨著微流體和微型技術(shù)的快速發(fā)展，在過去的十年里，便攜式、高度集成和易于操作的流動(dòng)系統(tǒng)得到了發(fā)展。例如，Jiang等人通過耦合電動(dòng)誘導(dǎo)的壓力驅(qū)動(dòng)流進(jìn)行熒光顆粒計(jì)數(shù)，設(shè)計(jì)了一種小型化的雙波長熒光檢測芯片。Kanwa等人使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造了一種形狀像葫蘆的微流體裝置，用于捕獲和定量分析染色的外泌體。Lee等人提出了一種聲學(xué)納米過濾系統(tǒng)，該系統(tǒng)以連續(xù)和非接觸的方式分離特定尺寸的微囊泡。這些新的細(xì)胞檢測設(shè)備豐富了流式細(xì)胞儀設(shè)備家族。
然而，F(xiàn)C的性能是關(guān)鍵參數(shù)之一對(duì)其他參數(shù)的折衷，從而限制了它的應(yīng)用。生物樣本的形態(tài)特征通常是幫助區(qū)分一個(gè)群體與另一個(gè)群體的關(guān)鍵參數(shù)之一。例如，大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性桿菌，其長度在1到幾十微米之間，反映出獨(dú)特的活性。在采用橢圓形和球形焦斑的傳統(tǒng)FC中，無法檢測到細(xì)胞在通過截距點(diǎn)時(shí)的大小、形狀和方向的差異，這使得區(qū)分活性細(xì)胞變得困難。相比之下，當(dāng)非球形物體經(jīng)過時(shí)，具有大縱橫比的焦斑（例如，光片）會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的強(qiáng)度分布（圖1）。Miura等人將光片實(shí)現(xiàn)為定制的IFC，旨在將每個(gè)圖像像素的熒光強(qiáng)度提高約10倍。據(jù)我們所知，這些研究人員都沒有利用高縱橫比的焦斑來提高FC的空間分辨率。

在這項(xiàng)研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)，使用高度各向異性和抗衍射的光片（ADLS）作為激光攔截點(diǎn)。ADLS是由空間光調(diào)制器（SLM）通過條紋分裂相位（SSP）方法產(chǎn)生的平行且緊密排列的貝塞爾-高斯光束形成的。貝塞爾-高斯光束是一種具有矢量偏振的光束。它具有幾個(gè)驚人的特性，例如抗衍射、自愈、大焦深和低干涉，即使其中兩個(gè)是平行且緊密放置的。因此，可以使用具有大面積和良好均勻性的貝塞爾-高斯光束陣列來生成ADLS。此外，自我修復(fù)功能使ADLS在通過復(fù)雜解決方案時(shí)不會(huì)失真。在目前的研究中，ADLS的尺寸為12μm長，12μm寬，0.8μm厚度。該規(guī)范使我們能夠以亞微米的空間分辨率測量大型和小型物體。穿過不同大小、分布甚至姿態(tài)的物體會(huì)產(chǎn)生不同的強(qiáng)度分布，可以對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。對(duì)于傳統(tǒng)FC來說，這是無法實(shí)現(xiàn)的。結(jié)合光電倍增管和高速數(shù)據(jù)采集模塊，500 kHz可以容易地實(shí)現(xiàn)采樣率。最大計(jì)數(shù)率可以是每秒至少104個(gè)事件。因此，所提出的方法大大提高了傳統(tǒng)FC的空間分辨率，適用于對(duì)具有復(fù)雜物理和化學(xué)特征的生物樣本進(jìn)行分選和分析。
系統(tǒng)設(shè)置
實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖2a所示。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，473nm，連續(xù)波激光器作為光源。激光束首先被空間濾光片過濾，然后被擴(kuò)束器準(zhǔn)直。通過分束器進(jìn)一步調(diào)整光束，和偏振器。穿過偏振器后，線偏振光束的方向與SLM的液晶的方向平行。調(diào)制光束進(jìn)一步被引導(dǎo)到倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)中，并用物鏡聚焦，以在焦點(diǎn)處產(chǎn)生ADLS。顯微鏡有一組濾光片，包括二向色鏡和帶通濾波器，從激發(fā)光中提取熒光。

使用流式細(xì)胞術(shù)制造的微流控芯片中的ADLS實(shí)現(xiàn)顆粒檢測、測量和分析（圖2a插圖）。微芯片有三個(gè)入口。A和C入口用于水流，而B入口用于樣品溶液。這三種溶液在接頭O處接觸，并在下游形成鞘流。微通道AO、BO和CO為100μm寬度為10μm在高度上。試驗(yàn)箱，即DO部分，為50μm寬度為10μm在高度上。
微流控芯片的空間位置由納米壓電臺(tái)改變，使ADLS位于微通道的中心。當(dāng)熒光顆粒以給定速度通過ADLS時(shí)，ADLS激發(fā)熒光顆粒發(fā)出熒光。熒光信號(hào)依次通過帶通濾波器和二向色鏡，然后被探測器捕獲。使用顯微鏡中的分束器，20%的熒光被SCMOS相機(jī)捕獲，以監(jiān)測ADLS。剩余的80%熒光被聚焦到光纖中，并用光電倍增管（PMT）。ADLS被放置在測試室中，以檢測射流中的樣品，如圖2c、d所示。相比之下，零階光點(diǎn)被聚焦到鞘流中。只有通過ADLS的樣品的熒光才能聚焦到光纖中。零級(jí)光激發(fā)的可能熒光已被阻斷。
PMT與放大器結(jié)合，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。然后，在嵌入式板上的16位模數(shù)轉(zhuǎn)換器收集并轉(zhuǎn)換為數(shù)字原始數(shù)據(jù)后，數(shù)據(jù)最終被發(fā)送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理和分析。系統(tǒng)的采樣率高達(dá)500 kHz.
微流控芯片的制備
根據(jù)圖3所示的程序，通過使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的軟光刻技術(shù)制造微通道。首先在硅晶片上使用負(fù)性光致抗蝕劑SU-8 3025制造溝道層。10分鐘后在預(yù)烘烤過程中，使用接觸掩模對(duì)準(zhǔn)器將涂有光致抗蝕劑的晶片暴露于紫外光下。后烘烤后通過開發(fā)，得到了模板。隨后使用PDMS復(fù)制模板的結(jié)構(gòu)。PDMS微通道進(jìn)一步粘合到載玻片上，并沖壓有入口和出口，以形成所需的微流體芯片。

免責(zé)聲明:文章來源汶顥www.whchip.com以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。

審核編輯 黃宇