基因療法能從根本上補(bǔ)充或修復(fù)缺陷基因，恢復(fù)健康基因的正常生物學(xué)功能，具有不可比擬的治療優(yōu)勢。腺病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）已經(jīng)成為預(yù)防感染、嚴(yán)重疾病和死亡的理想基因治療和疫苗載體。

載體進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并建立免疫記憶需要一種具有傳染性的活性病毒疫苗。傳統(tǒng)的定量檢測方法中，無論是靈敏度較高的qPCR檢測，還是傳統(tǒng)免疫學(xué)原理Elisa檢測等，僅可以定量病毒載體的總濃度。因受到病毒載體碎片干擾，而無法精確測定病毒疫苗載體的效價(jià)濃度，進(jìn)而影響基因藥物或疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制以及精準(zhǔn)給藥。因此，迫切需要一種可準(zhǔn)確測定病毒載體的濃度和存活力的新技術(shù)。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對上述問題，華中科技大學(xué)劉鋼教授和黃麗萍博士團(tuán)隊(duì)與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金梅林教授、張強(qiáng)副教授團(tuán)隊(duì)合作，研發(fā)了一種具有納米級多功能機(jī)器人手結(jié)構(gòu)的納米等離子體（Nano RHB）生物傳感器，用于快速、無損和特異性地捕獲和定量檢測腺病毒顆粒。該傳感器可應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測基因治療和病毒疫苗載體數(shù)量和質(zhì)量，評估病毒載體的感染活力。研究成果以“Versatile nanorobot hand biosensor for speci?c capture and ultrasensitive quanti?cation of viral nanoparticles”為題發(fā)表于Materials Today Bio期刊。

在該研究中，研究人員首先開發(fā)了一種基于非常光透射（EOT）效應(yīng)的無標(biāo)記Nano SPR生物傳感器。該生物傳感器可以被非偏振光激發(fā)，并且不需要復(fù)雜的光學(xué)設(shè)備。然后通過在納米杯陣列芯片上直接實(shí)施金種子生長法，設(shè)計(jì)了一種具有納米機(jī)器人手的新型多功能Nano SPR生物傳感器。由于其特殊的納米杯結(jié)構(gòu)作為種子模板，通過聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形狀的分枝狀金納米結(jié)構(gòu)。這些分支金納米結(jié)構(gòu)的功能類似于智能機(jī)器人手，從而增強(qiáng)SPR共振效應(yīng)以提高芯片的靈敏度，同時(shí)增加表面積以提高芯片修飾效率。將這些超靈敏生物傳感器集成到標(biāo)準(zhǔn)96孔板或32孔板中，可以直接監(jiān)測動態(tài)結(jié)合曲線，并使用微量樣品定量檢測腺病毒載體或疫苗。

使用Nano RHB平臺一步快速定量病毒顆粒

研究結(jié)果表明，基于該新型傳感器，將重組人CAR、FX蛋白或抗腺病毒六鄰體蛋白抗體固定在NanoRHB的表面，這些配體可以分別結(jié)合腺病毒的纖維蛋白（病毒衣殼上突出的刺突）和六鄰體蛋白（主要的衣殼蛋白），通過腺病毒特異性結(jié)合的CAR/FX蛋白相互作用可快速檢測腺病毒的生存活力和濃度，在5分鐘內(nèi)同時(shí)高通量檢測多達(dá)96個(gè)樣品，比傳統(tǒng)病毒滴度檢測方法和PCR方法更高效快捷。

基于CAR包被的Nano RHB平臺在5分鐘內(nèi)無標(biāo)記檢測腺病毒

此外，研究人員還使用凍干技術(shù)將CAR標(biāo)記的金顆粒整合到單克隆抗體修飾的Nano RHB平臺上，檢測靈敏度可以進(jìn)一步提高5倍。研究結(jié)果顯示，金顆粒偶聯(lián)的Nano RHB的獨(dú)特SPR效應(yīng)可實(shí)現(xiàn)一步式夾心法進(jìn)行高靈敏度和快速的腺病毒載體顆粒評估，而不需要洗滌步驟和復(fù)雜的樣品預(yù)處理。該種超靈敏金納米分支結(jié)構(gòu)修飾的生物芯片，不僅可以快速有效地評估腺病毒載體的活力，還可以通過一步夾心法提高檢測靈敏度至100 copies/mL。

研究人員進(jìn)一步將采用Nano RHB平臺檢測26個(gè)細(xì)胞上清液樣品，結(jié)果顯示與傳統(tǒng)qPCR和病毒滴度檢測分析的結(jié)果非常一致。Nano RHB傳感器分析顯著縮短了總檢測時(shí)間，從幾天和幾小時(shí)縮短到幾分鐘，并通過直接結(jié)合病毒表面蛋白來同時(shí)快速檢測病毒生存力和濃度，從而提高了檢測能力。該新型檢測平臺也展示出對不同類型的病毒載體和假病毒的高特異性。

研究結(jié)果顯示Nano RHB平臺是一種有前途的高通量生物檢測工具，用于高效和超靈敏地評估疫苗和基因遞送載體，用于大規(guī)模腺病毒載體疫苗的快速質(zhì)量控制，亦可用于其他基于病毒載體和基因載體的檢測分析。

研究團(tuán)隊(duì)已實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)的轉(zhuǎn)化，基于Nano SPR技術(shù)開發(fā)的一種腺相關(guān)病毒（AAV-2）定量檢測試劑盒，能準(zhǔn)確、快速、簡便、高通量的檢測細(xì)胞上清中AAV-2病毒含量。

AAV-2病毒定量檢測試劑盒的原理是AAV-2病毒上的衣殼蛋白和生物芯片表面AAV-2單抗結(jié)合后與芯片納米孔產(chǎn)生等離子共振效應(yīng)，引起特定波長處吸光度的改變。該波長處的吸光度的高低與樣本中的AAV-2病毒含量成正比。故可利用已知濃度的病毒樣品在Nano SPR芯片的特定波長處的吸光度變化，建立吸光度變化值與濃度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出待測樣本中的AAV-2病毒含量。

AAV作為基因治療的明星載體，是目前基因治療中最常用的載體，準(zhǔn)確的滴度檢測是AAV基因治療藥物質(zhì)控的重要組成部分，也是開展臨床研究的前提條件。

AAV-2病毒定量檢測試劑盒可搭配量準(zhǔn)多功能分子檢測儀（WeSPR 100或WeSPR HT96）使用，一步加樣，15min即可出結(jié)果，能準(zhǔn)確、快速、簡便、高通量的檢測細(xì)胞上清中AAV-2病毒含量。大大簡化了AAV開發(fā)者的工作流程。

在基因治療、抗病毒疫苗開發(fā)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景?；蛑委熁蛞呙玳_發(fā)過程中，對AAV衣殼濃度進(jìn)行完整、精確的測定，是前期研發(fā)，中期篩選中獲得可靠數(shù)據(jù)，后期治療中能夠安全有效給藥的必要條件。同時(shí)，測定AAV分離純化過程中不同階段的病毒濃度、優(yōu)化克隆、提高產(chǎn)量也十分重要。

華中科技大學(xué)博士生李睿、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生趙亞、華中科技大學(xué)博士生樊洪利為論文的共同第一作者，華中科技大學(xué)的黃麗萍博士、劉鋼教授及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的金梅林教授、張強(qiáng)副教授為該文的共同通訊作者。該工作得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委的資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2022.100444

審核編輯 ：李倩