硼親和材料對順式二醇類物質(zhì)具有獨(dú)特的親和性，已成為糖蛋白富集的有力手段。然而，硼酸和順式二醇基團(tuán)之間的親和力比免疫親和相互作用低3-6個(gè)數(shù)量級，導(dǎo)致其吸附能力受限。據(jù)報(bào)道，具有高度支化結(jié)構(gòu)的硼親和材料能夠?qū)⑵渑c糖蛋白的結(jié)合能力提高2-3個(gè)數(shù)量級。八乙烯基多面體低聚倍半硅氧烷（Ov-POSS）具有八個(gè)中心點(diǎn)且具有向外輻射的三維籠狀結(jié)構(gòu)，可以聚合形成樹枝狀結(jié)構(gòu)聚合物，高密度活性位點(diǎn)均勻分布于聚合物骨架表面，從而與目標(biāo)物官能團(tuán)產(chǎn)生強(qiáng)結(jié)合作用。

近期，天津醫(yī)科大學(xué)劉照勝、黃艷萍教授課題組報(bào)道了一種利用樹枝狀八乙烯基多面體低聚倍半硅氧烷（Ov-POSS）提高硼親和位點(diǎn)可及性來特異性富集糖肽和糖蛋白的新策略，并將制備的硼親和整體柱用作微流控平臺(tái)的一部分，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的在線分級、變性、酶解以及糖肽、泛素化肽的富集。相關(guān)成果以“Boronate Avidity Assisted by Dendrimer-like Polyhedral OligomericSilsesquioxanes for a Microfluidic Platform for Selective Enrichment ofUbiquitination and Glycosylation”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。

首先，研究人員提出以O(shè)v-POSS為核心形成樹枝狀聚合物的交聯(lián)策略。將3-（丙烯酰胺基）苯基硼酸（AAPBA）作為功能單體，制備出具有高硼親和位點(diǎn)密度的聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱（圖1）。

圖1 基于Ov-POSS的樹枝狀硼親和整體柱和傳統(tǒng)硼親和整體柱對比示意圖

隨后，研究人員比較了Ov-POSS交聯(lián)和不含Ov-POSS整體柱的吸附能力，結(jié)果表明聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱的吸附容量是常規(guī)非Ov-POSS交聯(lián)整體柱的27倍（圖2a）。通過糖蛋白（HRP、Trf）和腺苷的結(jié)合強(qiáng)度測定發(fā)現(xiàn)，與Trf（4個(gè)糖基化位點(diǎn)）和腺苷（1個(gè)糖基）相比，該樹枝狀硼親和材料對糖基數(shù)量多的HRP（9個(gè)糖基化位點(diǎn)）親和能力分別提高3個(gè)數(shù)量級和4個(gè)數(shù)量級（圖2b?d）。證明樹枝狀硼親和材料更有利于硼酸官能團(tuán)協(xié)同結(jié)合多糖修飾的糖蛋白。

圖2 （a）聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱和不含Ov-POSS整體柱對HRP的吸附等溫線；聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱與（b）HRP、（c）Trf和（d）腺苷結(jié)合的Scatchard圖

接下來，研究人員用SDS-PAGE和MALDI-TOF MS光譜研究了對糖蛋白和糖肽的特異性。如圖3a所示，BSA和HRP混合液經(jīng)過聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱處理后，非糖蛋白BSA條帶消失，表明該材料對糖蛋白優(yōu)異的選擇性。此外，HRP酶解液富集實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)富集的酶解液中僅檢測到1種糖肽（圖3b），而經(jīng)過富集后，以更高的信噪比檢測到23種糖肽（圖3c）。

圖3 糖蛋白和糖肽的特異性評估：（a）SDS-PAGE分析：泳道1：標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2：蛋白質(zhì)混合物；泳道3：上樣流出液；泳道4：淋洗液；泳道5：洗脫液；（b）未富集和（c）富集后胰蛋白酶HRP消化液

最后，將該樹枝狀硼親和整體柱用于構(gòu)建多功能微流控芯片平臺(tái)，在線處理小鼠肝臟蛋白質(zhì)，該平臺(tái)集成了蛋白質(zhì)分級、變性、酶水解和糖肽和泛素肽富集五個(gè)功能區(qū)（圖4）。與離線方法相比，蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理時(shí)間減少近一半，且新鑒定到86.7%的糖肽、75%的糖蛋白、100%的泛素肽和95.8%的泛素化蛋白。

圖4 微流控芯片集成平臺(tái)的示意圖

研究人員首次證明了Ov-POSS輔助硼酸單體形成樹枝狀結(jié)構(gòu)的策略，能夠顯著提高硼親和材料的親和力和位點(diǎn)可及性。最后，將該硼親和整體柱應(yīng)用于構(gòu)建微流控芯片平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)樣品的在線預(yù)處理，以及糖肽和泛素肽的同時(shí)鑒定。開發(fā)的微流控平臺(tái)為蛋白質(zhì)組學(xué)的自動(dòng)化、高效、高通量分析提供一種有前途的工具。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04005

審核編輯 ：李倩