01背景

高內(nèi)涵成像（High-content imaging）是一種基于生物圖像技術的高通量細胞成像篩選方法，它將自動多色熒光成像與量化數(shù)據(jù)分析相結合，以同時評估2D和3D細胞以及其他類型的生物樣本培養(yǎng)中單個細胞的多種分子特征。正因為光源技術與顯微鏡技術在過去幾十年所取得的驚人進步，HCI才成為可能。具體來說，顯微鏡現(xiàn)在能夠通過熒光激發(fā)與自動化程序獲取大量圖像，HCI正逐漸被研究人員采用，因為它能夠在使用數(shù)百、數(shù)千甚至數(shù)百萬種新化合物處理后，對許多細胞的活性進行無偏倚的多參數(shù)可視化和量化。

三維細胞培養(yǎng)技術 ( three-dimensionalcell culture, TDCC ) 是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng), 使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長, 構成三維的細胞-載體復合物。

三維細胞模型系統(tǒng)的高內(nèi)涵成像能比二維細胞培養(yǎng)更準確地反映體內(nèi)組織生理學和疾病病理生理學的測試活性：在2D培養(yǎng)中，只有與培養(yǎng)表面接觸的一側(cè)發(fā)生細胞吸附。許多細胞從組織中分離出來并置于平面細胞培養(yǎng)表面時，會逐步變得更加扁平，分裂異常，并喪失其分化表型。而在3D培養(yǎng)中，整個細胞表面都可以發(fā)生細胞吸附。細胞吸附和伸展的程度影響其增殖、凋亡和分化功能。3D培養(yǎng)可以建立起生理上的細胞-細胞與細胞-細胞外基質(zhì)相互作用，模擬天然組織的特異性，為提高候選藥物的臨床成功率提供了潛力。

當然，三維標本需要三維成像，因此關鍵在于達到成像系統(tǒng)主要部件（光源、顯微鏡和相機）的性能要求。

02挑戰(zhàn)

蘇黎世聯(lián)邦理工學院生物系統(tǒng)科學與工程系的顯微鏡工程師Tom Lummen博士對實施3D活細胞成像的要求以及如何使用虹科的CELESTA激光光源滿足這些要求提供了一些見解。

“我是運營成像核心設施的顯微鏡團隊的一員。我們提供20臺高端自動顯微鏡，以滿足我們部門用戶的成像需求。我們一直在尋找這些系統(tǒng)的新功能或擴展功能。我們有非常廣泛的成像應用，這些應用范圍從活細胞中的小亞細胞特征，必須在短時間內(nèi)可視化，一直到需要監(jiān)測數(shù)周的非常大的3D類器官或組織培養(yǎng)物的開發(fā)。旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的需求越來越大，因為數(shù)據(jù)采集需求正朝著獲取單細胞參數(shù)的方向發(fā)展，但具有非常好的統(tǒng)計數(shù)據(jù)和/或時間分辨率。我們的倒置旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)面向動態(tài)樣品的活細胞觀察，但我們也看到對高3D空間通量的需求增加。”

?????????????????????????????????????????旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡允許對活體樣品進行快速3D成像，激光束通過角錐棱鏡的小孔聚焦，平行地發(fā)送向磁盤。針孔周圍的微鏡反射一個光束回到角錐棱鏡里。每一個亞光束向后反射并通過針孔聚焦。熒光激發(fā)通過針孔聚焦，通過半反半透鏡傳送。旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡允許對活體樣品進行快速3D成像，激光束通過角錐棱鏡的小孔聚焦，平行地發(fā)送向磁盤。針孔周圍的微鏡反射一個光束回到角錐棱鏡里。每一個亞光束向后反射并通過針孔聚焦。熒光激發(fā)通過針孔聚焦，通過半反半透鏡傳送。

?????????????????????????????????????????但利用這種技術需要在競爭需求之間取得平衡。Lummen博士描述了所涉及的一些障礙，以及它們?nèi)绾斡绊懰退膱F隊，“在顯微鏡下，在設置系統(tǒng)時總是需要權衡，你不能同時擁有所有優(yōu)勢。我們試圖追求的是專用系統(tǒng)，但我們試圖使它們盡可能保持可調(diào)諧性。我們確定了對專用倒置旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)的需求，該系統(tǒng)面向高通量觀察，無論是空間還是時間。這時，我們開始探索有哪些照明技術。用于高速高通量活細胞成像的合適光源（與旋轉(zhuǎn)盤的速度配對）需要高度靈活，并提供高強度，時間穩(wěn)定的光輸出，并能夠在多條光譜線之間快速切換。

03解決辦法

虹科的CELESTA激光光源被確定為此類動態(tài)活細胞旋轉(zhuǎn)盤應用的理想照明源。Lummen博士與CELESTA分享了他的經(jīng)驗?！癈ELESTA與CrestOptics X-Light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀，Nikon Ti2顯微鏡和Teledyne Photometrics Kinetix sCMOS相機相結合，使我們能夠在同一時間跨度內(nèi)成像更多細胞，這可以按比例增加我們可以提供給用戶的數(shù)據(jù)吞吐量（圖1）。 圖 1. 在固定的Fucci4 HeLa細胞上進行五色成像。圖像是使用100X，NA 1.45油浸物鏡和25 mm FOVKinetix相機拍攝的強度投影。在配備CrestOpticsX-light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀，虹科CELESTA光引擎和TeledynePhotometrics Kinetix sCMOS相機的尼康Ti2顯微鏡上記錄。Fucci4是基于熒光蛋白mTurquoise，mClover，mKO和mMaroon的細胞周期依賴性表達的細胞周期位置指示劑。圖片來源：JavierCasares，D-BSSE，蘇黎世聯(lián)邦理工學院。

CELESTA的高強度輸出與Kinetix相機的大視場（FOV）相結合，使我們能夠在每個時間點成像更多的細胞，或者每個復合大圖像的圖塊更少。尼康Ti2和CrestOptics X-Light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀的大視場相結合，讓我們配置了雙攝像頭大視場設置（圖2）。這使我們能夠進一步復制數(shù)據(jù)吞吐量或在動態(tài)樣品中執(zhí)行真正的并發(fā)雙通道活細胞成像。此外，虹科CELESTA的光譜輸出將我們的成像能力擴展到近紅外（nIR）。

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04虹科CELESTA光源介紹

虹科CELESTA光源的光譜輸出與CELESTA實物圖
虹科-CELESTA——面向高端成像的固態(tài)激光光源

虹科CELESTA和CELESTA quattro光引擎包括4-7個可單獨控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個可選波長），并且支持快速切換。CELESTA光引擎在1.5mm直徑光纖的遠端出光，其7個激光器中的每一個都能提供約1000mW的輸出功率。同樣，CELESTA quattro光引擎以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個具有性價比的4或5線選擇。激光輸出與復雜的控制和監(jiān)測系統(tǒng)相結合，為旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學和其它高級成像應用提供所需的高清晰度性能。

?可廣泛應用于：細胞遺傳學；藥物研發(fā)/高內(nèi)涵篩選；基因表達分析；光遺傳學等