許多光學(xué)顯微鏡應(yīng)用，特別是涉及熒光成像的應(yīng)用，需要波長(zhǎng)辨別，要么過(guò)濾寬帶照明源，要么過(guò)濾到達(dá)相機(jī)的圖像，或者兩者兼而有之。用于波長(zhǎng)過(guò)濾的傳統(tǒng)工具，如AOTF單色儀和濾光輪，都有不同程度的限制，這通常會(huì)影響它們?cè)陲@微鏡中的使用。

虹科柔性波長(zhǎng)選擇器（FWS）是一種新型波長(zhǎng)濾波設(shè)備，為照明和圖像濾波提供了優(yōu)勢(shì)的組合。具體地說(shuō)，虹科FWS器件將單色器的波長(zhǎng)可調(diào)諧性和帶寬控制與濾光輪的圓形均勻孔徑相結(jié)合，這些設(shè)備具有緊湊、操作簡(jiǎn)單和明顯成本效益的優(yōu)點(diǎn)。在這篇文章中，我們描述了這項(xiàng)新的專(zhuān)利技術(shù)，并討論了它在顯微鏡方面的優(yōu)勢(shì)。

熒光探針的標(biāo)測(cè)是基于波長(zhǎng)選擇性成像，源波長(zhǎng)與目標(biāo)熒光團(tuán)的吸收峰匹配以獲得最佳激發(fā)。在同一實(shí)驗(yàn)中使用多個(gè)熒光團(tuán)的情況下，使用兩個(gè)不同的波長(zhǎng)可以選擇性地激發(fā)每個(gè)熒光團(tuán)。以這種方式，可以在包括來(lái)自激發(fā)源的散射和其他波長(zhǎng)的熒光的背景下以最大信噪比選擇性地觀察來(lái)自每個(gè)熒光團(tuán)的斯托克斯位移熒光。

波長(zhǎng)選擇性和可調(diào)諧性在其他類(lèi)型的光學(xué)顯微鏡中也是有用的，例如用于對(duì)沒(méi)有內(nèi)源性熒光或添加熒光團(tuán)的透明樣品成像的相位對(duì)比度和傾斜照明方法。這里眾所周知，迭代地改變（調(diào)整）照明條件，特別是波長(zhǎng)，可以選擇性地優(yōu)化圖像場(chǎng)內(nèi)不同目標(biāo)的對(duì)比度。

不同濾波技術(shù)的限制

濾波器

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在顯微鏡的檢測(cè)部分，濾光片和二向色分束器是在相機(jī)或目鏡之前進(jìn)行波長(zhǎng)濾波的常用手段。這些濾波器可以與寬帶光源一起使用，用于波長(zhǎng)選擇性照明，而不是LED或激光器。濾波器通?；诒∧る娊橘|(zhì)，有時(shí)結(jié)合彩色玻璃用于額外的波長(zhǎng)阻擋。對(duì)于單個(gè)熒光團(tuán)，通常在相機(jī)之前使用帶通或截止濾波器。對(duì)于兩個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)，可以使用二向色電介質(zhì)分束器根據(jù)波長(zhǎng)將光分成兩個(gè)相機(jī)，或者熒光團(tuán)可以使用單個(gè)相機(jī)前面的濾光輪交替成像。

濾波器和濾波器輪的局限性在于它們?nèi)狈`活性，因?yàn)槊總€(gè)濾波器的帶通波長(zhǎng)和中心波長(zhǎng)是固定的。因此，圖像不能作為波長(zhǎng)的函數(shù)進(jìn)行掃描，也不能迭代地調(diào)整波長(zhǎng)和帶寬以找到特定樣本的最佳（例如，高對(duì)比度）觀看條件。

單色儀

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單色儀基于衍射光柵或色散棱鏡對(duì)光源輸出進(jìn)行選擇。為了過(guò)濾光源，輸出狹縫或光纖僅用于選擇目標(biāo)波長(zhǎng)窗口，通過(guò)旋轉(zhuǎn)光柵（或棱鏡）角度來(lái)連續(xù)地調(diào)諧該頻帶的中心。通過(guò)調(diào)節(jié)輸入和輸出狹縫的寬度，也可以平滑地改變透射光的帶寬。然而，在圖像檢測(cè)過(guò)程中并不常用單色器。原因是相機(jī)陣列的只有一個(gè)軸可以用于成像，另一個(gè)軸用于波長(zhǎng)色散。因此，圖像必須單行或單像素進(jìn)行構(gòu)建。

聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF）

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AOTF是基于將射頻（RF）輸入施加到諸如二氧化碲（TeO2）之類(lèi)的奇異晶體的固態(tài)組件，由此產(chǎn)生的聲學(xué)振動(dòng)起到移動(dòng)衍射光柵的作用。AOTF的主要優(yōu)點(diǎn)是切換時(shí)間快，可以同時(shí)控制多個(gè)輸出。然而，它是一個(gè)復(fù)雜的射頻供電系統(tǒng)，成本相對(duì)較高。AOTF也具有較差的帶外消光。

虹科FWS-新型濾波技術(shù)

虹科FWS將其中兩個(gè)寬帶帶通濾波器組合在一個(gè)緊湊、不透光的外殼中。這種設(shè)計(jì)使得每個(gè)濾波器的入射角能夠獨(dú)立旋轉(zhuǎn)。虹科FWS提供了具有濾波器的大凈孔徑的單色儀的波長(zhǎng)靈活性和精度，高帶外消光以及幾乎不受溫度或濕度變化影響的性能。此外，它簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、堅(jiān)固，可以作為顯微鏡的小型設(shè)備進(jìn)行封裝。

虹科FWS產(chǎn)品的帶寬可以從大約1.5納米調(diào)整到20納米（標(biāo)稱(chēng)），并且，中心波長(zhǎng)可以從大多數(shù)可見(jiàn)波長(zhǎng)（350 nm–900 nm）中選擇。由于它們需要準(zhǔn)直光，顯微鏡中的無(wú)限空間（即，在相機(jī)之前）是基于該技術(shù)的緊湊型設(shè)備的理想位置。此外，準(zhǔn)直輸入/輸出允許簡(jiǎn)單的光纖耦合，簡(jiǎn)化集成。這些特性使其成為相機(jī)和顯微鏡光源中光譜濾波的理想選擇。

虹科波長(zhǎng)選擇器的TwinFilm專(zhuān)利技術(shù)

如圖所示，可以將虹科FWS用于激發(fā)和發(fā)射。對(duì)于激發(fā)，有必要選擇最佳波長(zhǎng)以獲得最大效率，并避免多熒光團(tuán)實(shí)驗(yàn)中的交叉激發(fā)。對(duì)于發(fā)射，可以掃描整個(gè)波長(zhǎng)范圍以進(jìn)行光譜成像。

對(duì)于多重標(biāo)記的多色熒光成像非常有用。在用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記細(xì)胞的不同部分后，可以使用虹科波長(zhǎng)選擇器進(jìn)行同時(shí)成像。下圖顯示了分別標(biāo)記有DAPI（細(xì)胞核）、CMFDA綠（胞漿）和線粒體深紅色FM（線粒體）的固定HeLa細(xì)胞的熒光圖像。無(wú)需三種濾波器組或單色儀耗時(shí)掃描，可使用虹科FWS多邊形同時(shí)進(jìn)行三色成像。

使用不同染色劑標(biāo)定的HeLa細(xì)胞的熒光圖像

虹科波長(zhǎng)選擇器的優(yōu)異性能，使其具有廣泛的應(yīng)用范圍和巨大的市場(chǎng)前景，可代替單色儀、AOTF等用于熒光顯微鏡、高光譜成像、生命科學(xué)儀器、機(jī)器視覺(jué)、實(shí)驗(yàn)室研究、光源檢測(cè)、高光譜成像等多個(gè)領(lǐng)域。