透射電子顯微鏡(TEM)是研究材料微觀結(jié)構(gòu)的重要工具,其樣品制備是關(guān)鍵步驟，本節(jié)旨在解讀TEM樣品的制備方法。

透射電子顯微鏡(TEM)是研究材料微觀結(jié)構(gòu)的重要工具,其樣品制備是關(guān)鍵步驟。 以下是TEM樣品制備的主要技術(shù)：

1.機(jī)械研磨和離子濺射：將樣品機(jī)械研磨成極薄片,再通過離子濺射進(jìn)一步變薄至電子穿透可見。適用于硬質(zhì)材料。

2.聚焦離子束(FIB)加工：利用聚焦離子束對樣品表面進(jìn)行精密切割和薄膜制備,制備出厚度均勻的電子透射薄膜。適用于各種材料。

3.超薄切片技術(shù)：將樣品先用樹脂包埋固定,然后用超薄切片機(jī)切出厚度僅幾十納米的超薄切片。適用于生物樣品和軟質(zhì)材料。

4.電化學(xué)拋光技術(shù)：利用電化學(xué)原理在樣品表面進(jìn)行局部溶蝕,制備出具有特殊形貌的電子透射薄膜。適用于金屬和合金材料。

綜上所述,不同的TEM樣品制備技術(shù)適用于不同類型的材料,關(guān)鍵在于根據(jù)材料特性選擇合適的制備工藝。制備高質(zhì)量的TEM樣品是開展材料微觀結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)。

TEM樣品載網(wǎng)

樣品載網(wǎng)有不同的形狀和材料，最常用和最便宜的是銅網(wǎng)，它們的外徑通常為3毫米，并有多種篩孔尺寸可供選擇。

載網(wǎng)中間有一個(gè)大孔，需要覆蓋一層電子透明薄膜。粉末最常用的薄膜是碳膜或孔狀碳膜。這些薄膜對電子幾乎是透明的，因此只需很少的樣品制備工作就能輕松觀察粉末樣品。雖然這些薄膜可以在實(shí)驗(yàn)室制作，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都會購買預(yù)制的薄膜以滿足自己的特殊要求。

圖1 在TEM中用于固定試樣的銅網(wǎng)和樣品桿

除了保留樣品原生狀態(tài)下的形態(tài)和成分這一目標(biāo)之外，樣品制備的主要考慮因素是獲得足夠薄的切片，以便電子束能夠穿過整個(gè)樣品并從另一側(cè)射出。

樹脂聚合物用于支撐樣品：比如柔軟的生物、聚合物、粘土或微粒，通常在切片前嵌入樹脂聚合物中。樹脂聚合物必須堅(jiān)硬，且有一定彈性，可以支撐樣品并能從樣品塊中取出薄片（如70nm厚薄片）。如果樣品是冷凍的，則無需在切片前進(jìn)行樹脂包埋。

天然硬質(zhì)材料也可以通過其他方法制成薄片，例如切割小塊，然后將中心區(qū)域凹陷、研磨、拋光或用離子束減薄。這樣制作出的薄片無需進(jìn)一步支撐。但這些工藝通常只用于熱穩(wěn)定或無機(jī)硬質(zhì)材料，如金屬和陶瓷。

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圖2 一個(gè)制備不好的試樣，只有一小部分透射。熱軋鎂試樣，使用明場 STEM 模式成像。

有機(jī)類樣品制備方法

有機(jī)類和生物類樣品在TEM制備中有以下一些特點(diǎn): 1結(jié)構(gòu)敏感性：有機(jī)及生物樣品通常較為脆弱,很容易在制樣過程中受到損壞。需要特殊的固定、浸漬和脫水方法來保護(hù)樣品結(jié)構(gòu)。2水含量高：這類樣品大多含有大量的水分子,需要經(jīng)過脫水處理才能制備出真空下穩(wěn)定的薄膜。3.低襯度：生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等原子序數(shù)低,在電鏡下對比度較低,需要使用染色或其他增強(qiáng)手段。4制樣困難：由于組織脆弱和含水量高,采用切片等機(jī)械手段制備薄膜很容易造成切片變形或斷裂。需要更精細(xì)的微切方法。5.電子束敏感：這類樣品在電子束輻射下很容易發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞或化學(xué)反應(yīng),需要控制電子束強(qiáng)度和照射時(shí)間。6.取樣要求高：需要從復(fù)雜的生物樣品中精確地切割出感興趣的區(qū)域進(jìn)行觀察,操作難度大。

總之,有機(jī)和生物類樣品由于其結(jié)構(gòu)脆弱、含水量高等特點(diǎn),TEM制樣需要更加復(fù)雜精細(xì)的處理方法。樣品制備是觀察這類樣品的關(guān)鍵步驟。

對于生物類樣品，有三種主要的樣品制備方法可以保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)襯度。它們是：低溫固定法、化學(xué)固定法和負(fù)染色法。

選擇哪種技術(shù)處理樣品取決于樣品的性質(zhì)、研究的目的以及設(shè)備類型。如果需要標(biāo)記以精確定位蛋白質(zhì)的樣品（免疫標(biāo)記），或需要切成薄片以觀察固有形態(tài)的樣品，就需要不同的方案。如果只想看到樣品的輪廓或表面形狀，則需要負(fù)染色技術(shù)。

無機(jī)類樣品制備方法

無機(jī)類硬質(zhì)樣品在TEM制備中有以下幾個(gè)主要特點(diǎn):

1高硬度和脆性:無機(jī)材料如金屬、陶瓷等通常更硬且更脆。2制樣困難:由于硬度高,很難采用切片等機(jī)械手段制備出均勻、無損的薄膜樣品。需要采用離子轟擊、機(jī)械研磨等更復(fù)雜的制備方法。3電子束輻射敏感:一些無機(jī)材料在電子束照射下會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化或破壞。需要優(yōu)化電子束強(qiáng)度和樣品厚度等參數(shù)。4.厚度控制困難:由于硬度高,很難精確控制樣品厚度達(dá)到TEM觀察的最佳范圍(通常20-100 nm)。需要多次嘗試優(yōu)化。5.取樣難度大:有時(shí)需要從塊狀樣品中切割出合適的薄片區(qū)域進(jìn)行觀察,這對取樣位置的選擇提出了很高要求。

總之,無機(jī)硬質(zhì)樣品的TEM制備需要更專業(yè)的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn),操作過程更加復(fù)雜和困難。掌握適合的制備方法是重要的。

粉末

散裝易碎材料需要先粉碎成小顆粒或粉末，然后再放到樣品載網(wǎng)上，這可以通過使用小的瑪瑙杵和研缽來實(shí)現(xiàn)，在材料上來回?fù)u動研杵，使其破碎。碾碎成細(xì)粉后，粉末顆粒需要分散，然后再滴到載網(wǎng)或支撐膜上。為此，可將粉末加入乙醇等溶劑中，然后在密閉的小瓶/容器中進(jìn)行短時(shí)間（如 30 秒至幾分鐘）的超聲處理。然后用移液管將一滴懸浮材料滴到載網(wǎng)/支撐膜上，顆粒沉降到載網(wǎng)表面，在TEM中觀察之前必須讓溶劑完全揮發(fā)。 大塊材料

堅(jiān)硬的金屬樣品可以用金剛石鋸片切割成薄片。鋸片切割時(shí)，會沿切割邊緣噴灑液體作為潤滑劑并減少熱量。使用這種鋸片將是 TEM 樣品制備過程的開始，因?yàn)殇徠瑹o法切割出足夠薄的樣品以供觀察。它們需要進(jìn)一步變薄。

圖3塊狀樣品TEM制備傳統(tǒng)制備流程

1 超聲波圓盤切割

使用超聲波圓盤切割器從切片樣品中切割出一個(gè) 3 毫米的圓盤。管狀刀片利用振動向下切割樣品，如果切割后圓盤沒有留在原位，就會從切割管內(nèi)彈出。然后，圓盤需要通過機(jī)械研磨或凹陷來減薄。

安裝樣品以準(zhǔn)備切割圓盤可能需要將切片粘在金屬板上?？梢允褂玫蜏厝埸c(diǎn)蠟，然后加熱去除。將金屬底座放在約70攝氏度的熱板上，涂上少量蠟，使其熔化。從熱板上取下支架，立即將樣品放在支架表面融化的蠟上。也可以用磁力將金屬底座吸附到超聲波圓盤刻刀板上。

將所需區(qū)域?qū)?zhǔn)切割工具。在樣品上放少量切割介質(zhì)。將切割工具降至樣品表面，用移液管或注射器將粉末潤濕，開始切割。

當(dāng)圓盤完全切過樣品切片后，提起切割工具，取下樣品板，在熱板上再次加熱金屬板，取出樣品。

2 機(jī)械拋光和電拋光

有多種拋光方法：機(jī)械拋光、超聲波拋光、化學(xué)拋光和電拋光。

機(jī)械拋光也可以通過手工拋光來實(shí)現(xiàn)。將樣品安裝在三腳架拋光機(jī)上，拋光機(jī)的表面可以在砂粒浸漬的圓盤上做掃動和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。樣品的位置可以通過千分尺螺釘在支架上進(jìn)行調(diào)整。

可以在布盤上裝載金剛石膏或其他磨粒。標(biāo)準(zhǔn)的做法是，隨著拋光的逐步完善，使用較小等級的磨粒。這樣做的目的是使表面光滑如鏡，沒有劃痕。培養(yǎng)良好的拋光技能需要投入大量時(shí)間。

電拋光技術(shù)只適用于金屬樣品。它使用一個(gè)溫度可控的浴槽和一股電流。浴槽充當(dāng)電解質(zhì)。它通常是一種濃酸或酸的混合物。陽極和陰極浸入電解液中。陽極（待拋光樣品）連接到直流電源的正極，陰極連接到負(fù)極。陽極表面的金屬被氧化并溶解在電解液中。拋光過程的工作原理是首先去除較高的形貌。

3釘薄Dimpling

對圓盤中心進(jìn)行減薄稱為"釘薄"或"凹陷研磨"。這種技術(shù)可以將一些樣品減薄到足以觀察的程度，但更常用于預(yù)減薄到接近電子透明的程度，這樣可以大大減少后期離子研磨的時(shí)間，并防止減薄不均勻。

塊狀樣品應(yīng)從兩面進(jìn)行凹凸處理（釘薄輪）。如果樣品的相關(guān)區(qū)域位于一個(gè)表面上（例如基底上的薄膜），則應(yīng)只從"背面 "進(jìn)行點(diǎn)凹加工。在開始點(diǎn)凹之前，先測量樣品的初始厚度，以確定何時(shí)點(diǎn)凹足夠深。

使用磨料粉來減薄樣品圓片。隨著薄化的進(jìn)行,應(yīng)使用粒度越來越小的磨料。當(dāng)下一個(gè)更小粒度的磨料去除的厚度約為當(dāng)前磨料粒度的3倍時(shí),效果最佳。最后一步可用于制造無劃痕的鏡面。

理想情況下，成品圓盤的邊緣厚度應(yīng)為300 μm，中心厚度應(yīng)小于10 μm。單面凹痕的邊緣厚度應(yīng)為150 μm。

需要經(jīng)常停止研磨過程，并使用刻度盤上的微米刻度檢查凹痕的深度。通常情況下，如果中心位置破了，那么樣品將失去作用，需要重新開始制程。

4 離子束減薄

離子束減薄用于輕柔地去除試樣上的材料，而不會造成損壞。這一過程通常被稱為精密離子拋光。一束離子（通常為氬離子）射向試樣圓盤的中心。離子束以淺角度（通常約 5°）射向試樣。如果試樣已通過凹陷研磨預(yù)先變薄，則離子拋光會進(jìn)一步使試樣變薄，直至形成穿孔。如果試樣沒有經(jīng)過凹陷研磨，則仍可使用 PIP 研磨試樣的整個(gè)厚度，但在某些情況下，這需要的時(shí)間太長，因此并不可行。因此，用于離子拋光的試樣厚度通常小于100微米。

5 聚焦離子束（FIB ）銑削

聚焦離子束（FIB）可用于通過非機(jī)械方法制備用于 TEM 的薄樣品。一些樣品可以用FIB相對快速地切割，不到一個(gè)小時(shí)就可以制備好。

需要使用FIB技術(shù)的材料包括：1.需要薄橫截面進(jìn)行觀察，但因硬度太高而無法使用超薄切片技術(shù)刀的硬樣品。2.需要精確定位（至 20 納米）制備樣品的樣品。3.會被機(jī)械切割、研磨或拋光損壞的材料。 FIB制備TEM樣品是一種高效而精準(zhǔn)的方法,具有以下優(yōu)勢：

1.精細(xì)取樣能力：FIB可以精確地從復(fù)雜的樣品表面切割出極小區(qū)域(通常幾十微米大小)進(jìn)行觀察,取樣精度高。

2.無需復(fù)雜制備：相比傳統(tǒng)的超薄切片法,FIB直接從原始樣品表面"切出"薄膜,免去復(fù)雜的樹脂包埋、超薄切片等步驟。

3.制樣時(shí)間短：整個(gè)FIB制樣過程可以在即使分鐘到幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成（取決于樣品）,大大縮短了樣品制備周期。

4.適用于多種樣品：FIB可以用于金屬、陶瓷、半導(dǎo)體、生物等各種硬質(zhì)無機(jī)樣品的制備。

5.原位觀察能力：FIB制樣可以直接在SEM內(nèi)部完成,實(shí)現(xiàn)了原位觀察。

6.靈活性高：FIB制樣過程可以根據(jù)需求進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控和優(yōu)化。

總之,FIB制備TEM樣品是一種高效、精準(zhǔn)的方法,是材料分析中不可或缺的重要手段。

制樣產(chǎn)生的假象

在TEM樣品中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)假象。這可能是最初選擇樣品時(shí)出現(xiàn)的問題，也可能是在制備過程中產(chǎn)生的。TEM的成像目的是觀察一個(gè)沒有假象的樣品，所以能夠識別假象并確定其原因是非常重要的。 假象可能來自幾個(gè)來源。例如，在離子研磨/細(xì)化過程中，氬離子可能被注入到樣品中，這可能導(dǎo)致非晶化和相變。這是由于使用過高的加速電壓導(dǎo)致高能離子損壞樣品造成的。此外，化學(xué)制備程序也可能會在樣品上留下污染物。不良的機(jī)械拋光會產(chǎn)生不均勻的表面和劃痕，留下殘留物或在樣品中引入位錯。如果樣品超聲處理時(shí)間過長或選擇了錯誤的溶劑，即使是樣品載網(wǎng)上的顆粒制備也會產(chǎn)生假象。當(dāng)使用低溫技術(shù)時(shí)，樣品必須能夠在不損害結(jié)構(gòu)的情況下耐受低溫。

對于生物樣品，固定會引入假象。由于采集樣品和固定之間間隔時(shí)間過長，可能會導(dǎo)致樣品降解。如果固定溶液與樣品條件不匹配，就會發(fā)生滲透損傷。固定步驟之間的不良清洗會導(dǎo)致沉淀樣品中出現(xiàn)“胡椒狀pepper”。

冷凍固定也有與樣品厚度和太慢的冷卻速度相關(guān)的假象。脫水和樹脂滲透會導(dǎo)致假象。脫水過快會導(dǎo)致收縮假象。樹脂滲透和聚合不良會導(dǎo)致樣品中出現(xiàn)孔洞。

材料的超薄切片引入了另一組可能的假象:撕裂、擠壓或劃痕。

此外，樣品染色會導(dǎo)致表面沉淀。在檸檬酸鉛染色過程中，即使對樣品呼吸過重，也會導(dǎo)致碳酸鉛沉淀。設(shè)備(鑷子)和工作臺不清潔會導(dǎo)致油和污染物停留在樣品表面。 最后，在TEM樣品觀察中，如果電子束或等離子體過快地聚集到樣品上，也會損壞樣品或載網(wǎng)上的薄膜，這個(gè)問題非常重要。具體表現(xiàn)有以下幾個(gè)方面:

1樣品表面損壞：電子束的高能量聚焦會導(dǎo)致樣品表面產(chǎn)生局部過熱和熔融。這種效應(yīng)會嚴(yán)重破壞樣品的結(jié)構(gòu)和形貌,有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致樣品完全蒸發(fā)。對于一些敏感的有機(jī)樣品或生物樣品來說,這種損傷會尤其嚴(yán)重。

2載網(wǎng)薄膜破壞：如果等離子體在清洗的時(shí)候過于集中,也會損壞載網(wǎng)上的超薄碳膜或其他薄膜。薄膜破裂或穿孔會導(dǎo)致樣品丟失,或者觀察區(qū)域受到嚴(yán)重干擾。

3.成分變化：高能量照射還可能引起樣品的化學(xué)組成變化,如氧化還原反應(yīng)等。

這種成分變化會導(dǎo)致樣品的物理化學(xué)特性發(fā)生改變,影響觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.分辨率降低：局部過熱損壞會造成樣品表面形貌的粗糙化,降低了TEM觀察的分辨率。

為了避免這些問題,在TEM樣品觀察時(shí)需要合理調(diào)整電子束或等離子體的照射參數(shù),如電壓、電流密度、照射時(shí)間等,盡量減少樣品受損。同時(shí)還可以采用低溫、低劑量等特殊技術(shù)手段來保護(hù)樣品。只有樣品結(jié)構(gòu)和成分完整,才能獲得可靠的TEM觀察結(jié)果。