圖 1.(a) CARS [3] 和 (b) 多路復用 CARS的能量示意圖，顯示接地、虛擬和振動狀態(tài)。對于多路復用 CARS，通過用寬帶超連續(xù)脈沖代替窄帶斯托克斯光束來獲得多種振動模式。

概述

流行的分子成像技術(shù)只能揭示人體內(nèi)用色素或熒光蛋白標記的特定分子的分布或行為。然而，拉曼光譜允許研究人員通過光譜分析來識別未標記分子的成分。因此，振動(拉曼)光譜通常被稱為分子指紋圖譜。使用這種無標記分子成像增加了發(fā)現(xiàn)體內(nèi)意外變化和異常的可能性。

一種基于拉曼的創(chuàng)新技術(shù)，稱為超多重 CARS 光譜成像，在實驗和臨床應用中展示了小型化、無創(chuàng)、實時和細胞級分子診斷的巨大實用性。這項技術(shù)能夠通過在寬光譜范圍內(nèi)同時收集的定量光子數(shù)據(jù)來觀察和分析生物結(jié)構(gòu)和過程，并且正在不斷改進和改進。

例如，日本筑波大學的 Hideaki Kano 副教授和他的同事最近對活細胞(18 種顏色對應 18 個波數(shù))進行了超多路 CARS 光譜成像，每像素的有效曝光時間為 1.8 毫秒，這是迄今為止報道的光譜覆蓋范圍~3000 厘米-1.2

CARS 基礎知識

相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 得名于這樣一個事實，即這種非線性光譜技術(shù)不是使用傳統(tǒng)的單個激光器，而是利用一對非常強的相干激光束照射樣品，從而產(chǎn)生反斯托克斯頻率信號。雖然第一個激光器的頻率通常是恒定的，但第二個激光器的頻率可以調(diào)整，以使兩個激光器之間的頻率差等于感興趣的拉曼活性模式的頻率。這種特殊模式將是拉曼信號中唯一極強的峰。

CARS 比正常拉曼發(fā)射強幾個數(shù)量級。執(zhí)行 CARS 不一定需要光柵;如果寬帶干涉濾光片后面放置了檢測器，則可能會起作用。接下來介紹了 CARS 的數(shù)學和示意圖描述。參見圖 1a。

兩個頻率為哦1 和哦2(哦1>哦2 )相干相互作用以產(chǎn)生頻率較高的強散射光2 小時1-哦2.如果兩個激光器之間的頻率差 (哦1-哦2 ) 等于頻率哦m拉曼活躍的振動、旋轉(zhuǎn)或其他模式，然后是頻率。

換句話說，為了獲得強拉曼信號，應以這樣的方式調(diào)整第二個激光頻率哦2= 哦1-哦m.那么強散射光的頻率將是2 小時1-哦2= 2 小時1- (哦1-哦m) = ω1+ 哦m，它高于激勵頻率。

除了克服大多數(shù)生物分子的低信號強度外，CARS 還提供定向發(fā)射和窄光譜帶寬，不受自發(fā)熒光的干擾。CARS 研究包括微生物細胞、真核細胞、捕獲細胞、醫(yī)學組織、上皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、肺組織、乳腺組織、骨骼和皮膚。

CARS 顯微鏡的快速掃描功能對于研究實時動力學的研究人員來說非常寶貴。此外，與熒光顯微鏡技術(shù)相反，細胞可以在 CARS 中重復成像，而不會因光漂白而出現(xiàn)褪色問題。

多路復用 CARS 和超多路復用 CARS

多重 CARS(見圖 1b)是一種增強型 CARS 技術(shù)，它采用多通道檢測器(例如，科學級 CCD 或 CMOS 相機)與光譜儀耦合，以覆蓋相干拉曼信號的寬光譜范圍。

通過使用寬帶激光源(例如，超連續(xù)光源或飛秒激光源)代替可調(diào)諧激光 ω2，多路復用 CARS 信號的典型頻譜覆蓋范圍可以進一步擴展，達到約 3000 厘米-1.這種超多重 CARS 光譜成像方法足夠廣泛，可以檢測所有振動基本模式——包括至關(guān)重要的指紋區(qū)域(在該區(qū)域可以識別未知有機化合物并相互區(qū)分)以及 C-H 和 O-H 拉伸區(qū)域(有助于識別脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的粗略分子分布)。

新的超多重 CARS 實驗

2000 年春天，當 Hideaki Kano 博士作為博士生參加在舊金山舉行的 CLEO 會議時，他被使用光子晶體光纖生成超連續(xù)譜所吸引，這種光纖只需要飛秒激光振蕩器即可產(chǎn)生超連續(xù)譜 (SC)。后來，在東京大學的濱口實驗室開始了他的學術(shù)生涯后，他開發(fā)了一種利用 SC 生成的國產(chǎn)逆拉曼光譜系統(tǒng)(現(xiàn)在通常被稱為受激發(fā)拉曼損耗或 SRL)光譜系統(tǒng)。

在他的實驗過程中，Kano 博士碰巧發(fā)現(xiàn)了 CARS 信號，它非常強烈，實際上比反向拉曼(即 SRL)信號更容易檢測。他很快意識到，將 SC 生成與光譜儀相結(jié)合不僅在基礎光譜學領(lǐng)域，而且在光譜成像剛剛興起的生命科學領(lǐng)域也將是一個突破。

實驗裝置

Kano 博士的實驗裝置中集成了兩個激光源，以及具有超高 NIR 靈敏度的新型高讀出速度 CCD 相機和高通量光譜儀。參見圖2。

第一個基于主振蕩器光纖放大器 (MOFA) 配置的激光源涉及一個微芯片振蕩器——一種包含 Nd：YVO 的無源 Q 開關(guān)激光器4晶體與可飽和吸收鏡和摻鐿光纖放大器鍵合。第二個來源是無源 Q 開關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器。研究人員能夠根據(jù)所研究的樣品類型切換激光源，從而在波長、時間持續(xù)時間、重復頻率和輸出平均功率方面提供良好的實驗靈活性。

圖 2.超多重光譜 CARS 系統(tǒng)。禮貌筑波大學 Hideaki Kano 博士;改編自 OSAContinuum， 1693-1705 (2019)。

與 Kano 博士和他的同事在之前對活細胞進行超多重 CARS 光譜成像研究時使用的最先進的 CCD 相機相比，新推出的科學 CCD 相機提供的 NIR 靈敏度要高得多。

除了在重要的 NIR 活體成像波長下具有更高的靈敏度外，這款新相機還提供了與 Kano 博士時間分辨研究中使用的超快激光器同步所需的高速操作。研究人員將相機與高通量光譜儀耦合，該光譜儀分散鏡頭收集的 CARS 信號以供相機檢測。

在用于對活細胞進行成像之前，首先通過測量聚苯乙烯珠(直徑：10 μm)的 CARS 信號來評估實驗系統(tǒng)。在 600 cm 范圍內(nèi)檢測到微珠的超多重 CARS 信號-1至 3600 厘米-1跟分辨率 <10 cm-1.像素停留時間為 ~1 毫秒，從微珠中采集了 161 × 161 個像素的 CARS 圖像，總數(shù)據(jù)采集時間為 ~28 秒(圖 3)。

圖 3.苯環(huán)呼吸振動模式下的 CARS 圖像 (1003 cm-1)在不同的深度位置;圖像是利用被動Q 開關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器和 CCD 相機獲得的。分辨率為161 × 161 像素，總數(shù)據(jù)采集時間為 ~28 秒，盡管使用低成本的 Microchip 激光源。2由 Tsukuba 的 Hideaki Kano 博士提供大學;首次發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

活 A549 細胞的成像

在通過對聚苯乙烯珠子進行成像驗證系統(tǒng)的性能后，研究人員使用高速、高靈敏度的 CCD 相機和 MOFA 激光源對活細胞 (A549) 進行了成像(圖 4)。在2850 厘米-1在光譜上，以紅色渲染的亮點對應于單元內(nèi)的一個亮點，而該亮點又對應于中文2拉伸振動模式主要在細胞內(nèi)脂滴中觀察到。請注意，原始 CARS 信號由振動諧振信號和非諧振背景組成。這兩個組件相互干擾并產(chǎn)生分散的線形。

圖 4.(a) A549 細胞的光學圖像;(b) 2850 cm 處的 CARS 強度映射-1;(c) 在 (b) 中的兩個位置使用紅色和藍色叉表示的原始 CARS 信號的頻譜分布。圖像是使用 MOFA 激光源獲得的和 CCD 相機。由筑波大學的 Hideaki Kano 博士提供;第一發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

接下來，Kano 博士和他的同事通過進行數(shù)值分析提取純振動共振信號，以獲得自發(fā)拉曼等效光譜圖。他們發(fā)現(xiàn)這些所得光譜圖譜的主要特征分別與細胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的主要特征非常一致。十幾個特征拉曼帶之間3427 厘米-1和 1009 厘米-1對應于振動模式。

有關(guān)本研究的其他數(shù)據(jù)和更詳細的討論，請參閱以下文章：Hideaki Kano、Takumi Maruyama、Junko Kano、Yuki Oka、Daiki Kaneta、Tiffany Guerenne、Philippe Leproux、Vincent Couderc 和 Masayuki Noguchi，“具有 1 毫秒像素停留時間的超多路復用 CARS 光譜成像”，OSA Continuum 2,1693-1705 (2019)。

進展與展望

研究人員進行了超多重 (600 cm-1- 3600 厘米-1) 對活細胞進行 CARS 光譜成像，報告了光譜范圍為 ~3000 cm 的寬帶 CARS 迄今為止的最快時間-1.基于清晰的分子指紋，Kano 博士和他的同事可視化了具有超過 15 個振動帶的細胞內(nèi)分子分布。在軟件上 1 毫秒的曝光時間相當于每個像素的有效曝光時間為 ~1.8 毫秒，與 Kano 博士之前關(guān)于活細胞成像的研究(其中每個像素的曝光時間為 50 毫秒)相比，這是一個顯著的減少。這種改進主要歸功于新推出的 CCD 相機更高的靈敏度和讀出速度。2,7

這種高速技術(shù)與多變量分析方法的結(jié)合可以幫助生命科學家和醫(yī)生獲得對細胞內(nèi)代謝活動動態(tài)的有意義的見解。Kano 博士的研究小組目前正在與一名病理學家合作，使用分子指紋開發(fā)一種新的光譜診斷工具。

關(guān)鍵技術(shù)

為了促進他們最近的工作，研究人員選擇了Teledyne 普林斯頓儀器 BLAZE?相機采用專有的“超深耗盡型”CCD，由高電阻率塊狀硅制成8.該相機旨在產(chǎn)生任何可用硅器件中最高的近紅外量子效率，采用背照式 1340 x 400 光譜陣列格式(20 μm 方形像素)，能夠在空氣中冷卻至 -95°C，無需冷卻器或液體輔助，可實現(xiàn)低暗電流性能。

BLAZE 還為研究人員提供了 CCD 相機中最快的 ADC 速度。新傳感器平臺的雙 16 MHz 讀出端口經(jīng)過精心設計，可在完全垂直合并的情況下實現(xiàn)前所未有的超過 1600 個光譜/秒的光譜速率，在動力學模式下運行時高達 215 kHz。

與 BLAZE 相機配合使用的光譜儀是 Teledyne Princeton Instruments LS-785。由于其快速 f/2 光學系統(tǒng)和專有的 AR 涂層鏡頭可實現(xiàn)最佳近紅外透射，LS-785 可以實現(xiàn)高達 4 倍的標準 f/4 反射光譜儀的吞吐量。CCD 相機和基于鏡頭的光譜儀的所有功能和定時均在實驗裝置中通過 Teledyne 普林斯頓儀器 LightField?64 位軟件。

審核編輯 黃宇