實驗名稱：高壓放大器在介電泳效應(yīng)的細胞分選研究中的應(yīng)用

研究方向：生物醫(yī)學(xué)

測試目的：

細胞分選在分析化學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用。在眾多的分選方法中，微流控分選方法以其響應(yīng)速度快、樣品需求少等優(yōu)點成為研究熱門。微流控細胞分選法可分為被動分選法和主動分選法。被動分選法對待分選細胞的性質(zhì)無要求，且無需預(yù)標(biāo)記，對芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計及加工要求較高，且容易出現(xiàn)過濾結(jié)構(gòu)被堵塞等問題。主動分選法分選效率高，但對待分選的細胞通常有特殊要求，且大多需要對樣品進行預(yù)標(biāo)記等處理，嚴重影響細胞活性。

結(jié)合被動分選法和主動分選法的優(yōu)點，本文提出一種基于微結(jié)構(gòu)過濾法和介電電泳效應(yīng)的新型細胞分選方法。該方法在一定程度上克服了單一分選方法的弊端，有望解決微結(jié)構(gòu)過濾法普遍存在的堵塞問題。具體實現(xiàn)方式是在微過濾結(jié)構(gòu)區(qū)域集成微電極，通過調(diào)節(jié)過濾結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)和加載的交流信號參數(shù)，誘導(dǎo)形成可以驅(qū)動細胞往低場強區(qū)域運動的負向介電電泳效應(yīng)，進而避免待分選細胞在過濾孔區(qū)域的堵塞。

測試設(shè)備：ATA-2042高壓放大器、函數(shù)信號發(fā)生器、蠕動泵、筆記本電腦、科研級攝像頭、倒置熒光顯微鏡、單反相機等。

實驗過程：

①樣品溶液配制

使用非生物類樣品和生物類樣品來驗證所設(shè)計多級化分選微流控裝置。非生物類樣品選用37μm、16.3μm和9.7μm三種尺度不同的微粒混合而成，使用PBS緩沖液調(diào)節(jié)其濃度到104~105/mL水平；為防止微粒之間相互黏附以及微粒和芯片之間的黏附，在緩沖液內(nèi)加入0.1%v/v濃度的Tween20。實驗中使用的PBS緩沖液濃度為1mM，即10%濃度的PBS緩沖液，其電導(dǎo)率為0.17S/m，較低的電導(dǎo)率可以在一定程度上減少實驗過程中所產(chǎn)生的焦耳熱效應(yīng)，降低其對待分選的樣品活性的影響。

生物類樣品選擇了雨生紅球藻和片球藻的混合懸液。兩種藻類均培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基。取適量雨生紅球藻和片球藻混合在一起，細胞濃度調(diào)節(jié)至104~105/mL水平。需要注意的是，由于藻類密度較大，在初步的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)其極易沉底，在進樣口處形成堆積，且在微流控芯片內(nèi)部流動性較差，因此在每毫升混合藻細胞懸液中加入0.4g山梨醇。

②實驗平臺搭建

圖：實驗平臺

在進行實驗之前，要按實驗需求搭建實驗平臺。上圖所示所示為搭建好的實驗平臺。芯片出口通過導(dǎo)管與蠕動泵相連接。蠕動泵向外抽取液體，在芯片內(nèi)形成負壓，以此驅(qū)動待分選微粒或藻細胞的運動。信號發(fā)生器與電壓放大器相連后通過導(dǎo)電膠布與ITO電極連通，為芯片提供所需激勵信號。實驗過程的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)采用單反相機與倒置顯微鏡相結(jié)合的觀測手段來獲取，實現(xiàn)整個實驗過程的實時觀察和記錄。

③芯片預(yù)處理

在注入實驗樣本之前，需要對芯片進行預(yù)處理。在微粒分選實驗中，在芯片入口處加載不含微粒的10%PBS緩沖液；在藻細胞分選實驗中，在芯片入口處加載不含細胞的BG11培養(yǎng)液。在芯片毛細作用和親水性的共同作用下，緩沖液會快速充滿整個芯片通道。打開蠕動泵，設(shè)置抽取速度為1mL/min，并抽取5分鐘。該步驟的目的是完全消除芯片內(nèi)的氣泡，防止氣泡影響微粒的運動軌跡以及避免實驗中氣泡可能造成的電極電解問題。

④滴加樣品

使用移液器吸取50μL實驗樣本，加載于芯片入口處。在蠕動泵誘導(dǎo)的負壓作用下，上述樣品會在微流控芯片內(nèi)向出口處流動。

⑤加載信號

開啟信號發(fā)生器和電壓放大器，加載交流信號于ITO電極上。調(diào)節(jié)信號頻率和幅值，優(yōu)化分選效率。

⑥實驗記錄

打開單反相機，記錄實驗過程。

實驗結(jié)果：

圖：37μm、16.3μm和9.7μm微粒的分選過程（A1-A4）第一級過濾級分選效果；（B1-B4）第二級過濾級分選效果

第一級過濾級分選情況如上圖A1~A4所示，16.3μm微粒和9.7μm微粒不斷的通過微柱間距為25μm的第一級，而37μm的微粒在介電電泳力的作用下，一直在過濾孔附近運動，并沒有直接堵塞住過濾孔。當(dāng)微粒運動到第一級過濾結(jié)構(gòu)（過濾孔大小為25μm）附近時，直徑37μm、16.3μm、9.7μm的三種微粒會呈現(xiàn)出不同的受力及運動狀態(tài)：直徑37μm的微粒因大于過濾柱間的過濾孔尺度，必然不能通過該過濾級。該微粒在流向過濾孔的過程中，電場梯度不斷增大（兩微柱間過濾孔區(qū)域為最大電場強度梯度區(qū)域），所受負向介電電泳力nDEP也隨之增強，在曳力和nDEP作用下，微粒的運動速度會降低，并繼續(xù)保持向過濾孔區(qū)域運動。此時，微粒所受nDEP力進一步增強，直至能夠抵消細胞所受的曳力，達到受力平衡態(tài)。但微粒會繼續(xù)在慣性作用下向過濾孔區(qū)域運動，此時，在進一步增強的nDEP效應(yīng)下，微粒會被反向推離過濾孔區(qū)域。上述過程會反復(fù)進行，微粒會在此處呈現(xiàn)出振蕩狀態(tài)，運動往復(fù)軌跡不斷減小，直至達到相對平衡狀態(tài)，從而在過濾孔區(qū)域形成聚集而不堵塞過濾孔的分布態(tài)勢，避免傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過濾分選易出現(xiàn)過濾孔被微粒堵塞的情形發(fā)生。

第二級過濾級分選情況如上圖B1~B4展示，部分9.7μm到達過濾孔附近能夠立馬穿過過濾孔，其余9.7μm微粒會先在過濾孔附近聚集，然后連成串一起過去。當(dāng)16.3μm和9.7μm的微粒運動到第二級過濾級附近時，由于第二級過濾級的過濾柱的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，其電場梯度較第一級更強，直徑16.3μm的微粒形成的nDEP及曳力聯(lián)合作用下，使其呈現(xiàn)出與直徑37μm微粒在第一級過濾級相似的運動狀態(tài)，在第二級過濾級的過濾孔區(qū)域呈現(xiàn)堆積而不堵塞過濾孔的分布。同時，因尺度效應(yīng)受nDEP較小的9.7μm的微粒流通過兩微柱間的過濾孔進入后續(xù)結(jié)構(gòu)。

在不加載正弦激勵信號情況下，芯片很快就會因為過濾孔被堵塞而不能工作。本文在通過集成ITO微電極，借助負向介電電泳效應(yīng)較好地解決了傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過濾法存在的堵塞問題，能夠在很大程度上改善芯片的分選通量。

安泰ATA-2042高壓放大器：

圖：ATA-2042高壓放大器指標(biāo)參數(shù)

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